In silico и in vivo изучение противовоспалительной активности азометиновых производных 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида и 2-замещённых 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3h)-она

Основания Шиффа (азометины) представляют собой обширный класс органических соединений, которые проявляют различные виды биологической активности. Например, у них выявлены противогрибковые, антибактериальные, противомалярийные, антипролиферативные, противовоспалительные, противовирусные и жаропонижающие свойства [1]. В частности, имеются источники литературы, указывающие на наличие противовоспалительных свойств у данного класса веществ. Например, осуществлялось изучение противовоспалительной активности новых оснований Шиффа c тиадиазолом на трёх моделях: ингибирование денатурации белка и гемолиза эритроцитов, стабилизация мембраны эритроцитов и анализ ингибирования протеиназ. В результате установлено, что тестируемые соединения могут замедлять процесс денатурации белка. Все вещества эффективно уменьшали гемолиз, вызванный нагреванием, а также оказывали значительную антипротеазную активность, что может свидетельствовать о наличии у них противовоспалительных свойств [2]. Установлено, что основания Шиффа на основе 2-амино-5-хлорбензойной кислоты могут проявлять противовоспалительную активность, сопоставимую с ацеклофенаком [3]. Результаты фармакологических исследований синтезированных оснований Шиффа из 2-[(1,3-бензо-тиазол-2-ил)сульфанил]-N-[4-(гидразинкарбонил) фенил]ацетамида вывялили у них наличие противовоспалительной активности [4]. Для азометинов 7-гидрокси-4-формилкумарина и 7-метокси-4-фор-милкумарина in vitro установлено противовоспалительное действие на модели денатурации белка посредством ингибирования циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [5]. Также осуществлялась оценка противовоспалительной активности на модели in vivo, основанной на имитации воспалительного отёка путём инъекции свежего альбумина куриного яйца в лапу мыши, оснований Шиффа с фрагментами коричного альдегида и аминокислотами триптофаном или гистидином. Наибольшую противовоспалительную активность, сопоставимую по силе с аспирином, оказала структура, содержащая остаток триптофана [6]. Основания Шиффа на основе хиназолинона показали высокую противовоспалительную активность путём ингибирования фермента — микросомальной простагландин-синтазы (mPGES-1), снижение активности которой приводит к избирательному снижению биосинтеза простагландина Е2 [7]. По результатам молекулярного докинга были выбраны и затем целенаправленно синтезированы наиболее перспективные соединения с ядром 1,3,4-оксадиазола, которые могут оказать противовоспалительную активность. Дальнейшая in vivo оценка противовоспалительной активности полученных соединений показала, что некоторые из них проявляют активность, но уступают в силе фармакологического эффекта препарату сравнения индометацину [8]. Таким образом, рассматриваемый класс органических соединений является перспективным для разработки на его основе новых лекарственных средств с противовоспалительным действием.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования выступают азометиновые производные 2-амино-4,5,6,7-тетра-гидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида (3a-3s) и соответствующие им 2-замещённые 5,6,7,8-тетра-гидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3H)-она (4a-4s). Азометиновые производные образовывались в ходе взаимодействия 2-амино-4,5,6,7-тетра-гидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида ( 1 ) с ароматическими альдегидами ( 2 ) в среде этанола при слабом кипячении исходных соединений [9, 10]. Затем полученный продукт реакции ( 3 ) подвергли гетероциклизации до 2-замещённых 5,6,7,8-тетра-гидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3H)-она ( 4 ). Реакцию проводили в среде ледяной уксусной кислоты при добавлении каталитических количеств диметилсульфоксида (ДМСО) [11, 12]. Схема синтеза исследуемых соединений представлена на рисунке 1.

Молекулярный докинг проводился в свободно распространяемой программе Autodock 4.0 [13]. Молекулярное моделирование осуществлялось с учётом конформационной подвижности лигандов, торсионные углы которых были установлены и заданы в данной программе. Заряды всех атомов моделируемой системы рассчитаны алгоритмом

Рисунок 1 / Figure 1. Схема синтеза исследуемых соединений. Реагенты и условия: а — этанол, нагревание; b — ледяная уксусная кислота, ДМСО, нагревание / Synthesis scheme of the studied compounds. Reagents and conditions: a — ethanol, heating; b — glacial acetic acid, DMSO, heating.

Гастейгера (Gasteiger algorithm), и у них присутствуют только полярные атомы водорода. В программе был задан поиск 200 энергетически выгодных конформаций образования молекулярного комплекса изучаемых соединений с белковой мишенью с использованием ламарковской скоринговой функции подсчёта энергии взаимодействия (Lamarckian GA 4.2). Расстояние между точками сетки составляло 0,375 Å. Прогноз противовоспалительной активности проводился с использованием человеческой ЦОГ-2 с идентификационным номером 5IKT [14] из базы данных виртуальных структур RCSB Protein Data Bank (. В этом комплексе находится ингибитор данного фермента — толфе-намовая кислота. Областью вычислительного эксперимента является куб, центр которого находится по следующим координатам: x = 165,42, y = 185,74, z = 192,38. Количество точек в измерениях по осям x, y и z равно 46. Среднеквадратическое отклонение между местоположением толфенамовой кислоты в комплексе 5IKT (рентгеноструктурный анализ) и её расположением в лиганд-рецепторном комплексе по данным молекулярной стыковки составляет 0,86 Å (должно быть не выше 3 Å), что позволяет получить низкое различие между истинной и прогнозируемой конформацией моделируемой молекулы в активном сайте ЦОГ-2 согласно применяемому алгоритму молекулярного докинга [15].

Виртуальные структуры моделируемых соединений были построены в программе HyperChem 8.0.4, а затем геометрически оптимизированы методом молекулярной механики с использованием метода MM+, который позволяет получить приближённую равновесную геометрию молекулы без длительных вычислительных расчётов. Окончательная оптимизация геометрии виртуальных структур рассчитывалась в программе ORCA 4.1 с использованием теории функционала плотности (UB3LYP) и базового набора 6–311G** [16].

Изучение противовоспалительной активности синтезированных соединений проводили на модели острого экссудативного воспаления, вызван- ного субплантарным введением 2% раствора формалина в правую переднюю лапку мышей-самцов линии Balb/C весом 32,0–36,0 г (на момент начала эксперимента) в объёме 0,05 мл [17]. Исследуемые вещества вводили в дозе 50 мг/кг однократно перорально в виде водной суспензии за один час до введения формалина и при курсовом введении один раз в течение пяти суток. В качестве референтного средства использовали диклофенак (таблетки 50 мг), который вводили в дозе 50 мг/кг. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении: температура окружаю- щего воздуха 22 ± 2 °C, относительная влажность 65 ± 5%. Оценку прироста массы правой передней лапки проводили на пике воспаления через 3 часа после введения формалина путём взвешивания ампутированных передних лап мышей. Сравнение массы проводили между интактной (левой передней лапкой) и контрольной (правой передней лапкой).

Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики и проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Рассчитывали среднее значение (М) и стандартные ошибки среднего (m).

Таблица 1 / Table 1

Значения минимальной энергии лиганд-ферментного взаимодействия моделируемых соединений с активным сайтом ЦОГ-2 / Values of the minimum energy of ligand-enzyme interaction of the modeled compounds with the active site of COX-2

Соединение / Compound	Энергия, ккал/моль / Energy, kcal/mol	Соединение / Compound	Энергия, ккал/моль / Energy, kcal/mol
3a	-8,72	4a	-8,70
3b	-9,36	4b	-9,61
3c	-8,39	4c	-8,07
3d	-8,60	4d	-8,01
3e	-8,70	4e	-7,94
3f	-9,27	4f	-9,22
3g	-8,87	4g	-8,36
3h	-8,80	4h	-8,38
3i	-8,43	4i	-8,05
3j	-9,07	4j	-9,01
3k	-4,17	4k	-4,11
3l	-9,12	4l	-9,30
3m	-9,54	4m	-9,79
3n	-9,37	4n	-9,35
3o	-9,46	4o	-9,56
3p	-8,53	4p	-8,03
3q	-8,61	4q	-8,52
3r	-8,36	4r	-8,22
3s	-7,98	4s	-7,96
Толфенамовая кислота / Tolfenamic acid	-8,52	Диклофенак / Diclofenac	-8,21
Целекоксиб / Celecoxib	-8,35	Рофекоксиб / Rofecoxib	-8,30

Для нормального распределения в качестве параметрического критерия использовали критерий Стьюдента, а в случаях отличного от нормального распределения в качестве непараметрического критерия — U-критерий Манна — Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно данным молекулярного докинга наиболее перспективными соединениями среди азо-метиновых производных 2-амино-4,5,6,7-тетрагид-ро-1-бензотиофен-3-карбоксамида с точки зрения ингибирования ЦОГ-2 могут являться следующие структуры: 3b, 3l, 3m, 3n, 3o и получаемые из них пиримидиновые производные — 4b, 4l, 4m, 4n, 4o, энергия образования молекулярного комплекса которых превосходит виртуальные референты. При этом особый интерес представляют вещества 3m, 3n, 3o, 4m, 4n и 4o, так как в своей структуре содержат атом галогена, который, например, присутствует в структуре таких нестероидных противовоспалительных средств, как диклофенак, индометацин, эторикоксиб и целекоксиб.

Для дальнейшего изучения in vivo противовоспалительной активности было выбрано 10 наиболее перспективных соединений, исходя из данных предшествующего вычислительного эксперимента: 3b, 3l, 3m, 3n, 3o, 4b, 4l, 4m, 4n, 4o (таблица 1).

Исследование проводили на модели острого экссудативного воспаления, вызванного субплан- тарным введением 2% раствора формалина в правую переднюю лапку в объёме 0,05 мл. Первая серия опытов была скрининговой и выполнялась на ограниченном количестве животных (n=3). Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 / Table 2 Влияние исследуемых соединений в дозе 50 мг/ кг на экссудативную фазу острого воспаления (n=3) / The effect of the studied compounds at a dose of 50 mg/kg on the exudative phase of acute inflammation (n=3)

Соединение / Compound	Прирост массы лапы в % / Paw weight gain in %
3b	35,93 ± 3,05
3l	47,84 ± 3,59
3m	39,87 ± 6,65
3n	33,67 ± 2,63
3o	42,69 ± 2,08
4b	43,52 ± 1,87
4l	49,32 ± 4,58
4m	53,86 ± 5,51
4n	43,60 ± 6,32
4o	58,39 ± 7,01
Контроль / Control	67,06 ± 3,17

Таблица 3 / Table 3

Влияние исследуемых соединений и препарата сравнения на экссудативную фазу острого воспаления в дозе 50 мг/кг (n=8) при однократном профилактическом применении / The effect of the studied compounds and the reference drug on the exudative phase of acute inflammation at a dose of 50 mg/kg

(n=8) with a single prophylactic application

Соединение / Compound	Показатели / Indicators		Значение Р, отличия от контрольной группы в % / P-value, % of difference with the control group
	Прирост массы лапы в % / Paw weight gain in % М ± m	Прирост массы лапы, г / Paw weight gain, g М ± m
Контроль / Control	53,84 ± 8,56	0,090 ± 0,020	–
Диклофенак / Diclofenac	32,14 ± 5,47	0,054 ± 0,010	0,05 (– 40%)
3b	37,49 ± 5,42	0,062 ± 0,008	0,21 (– 31%)
3n	32,57 ± 7,46	0,055 ± 0,013	0,16 (– 39%)

Таблица 4 / Table 4

Изучение противовоспалительной активности соединений-лидеров при курсовом терапевтическом применении в дозе 50 мг/кг на модели формалинового отёка (n=8) / Study of the anti-inflammatory activity of leading compounds in the course of therapeutic use at a dose of 50 mg/kg on a model of formalin edema (n=8)

Соединение / Compound	Прирост массы лапы, г / Paw weight gain, g М ± m	Значение Р, отличия от контрольной группы в % / P-value, % of difference with the control group
Контроль / Control	0,090 ± 0,006	—
Диклофенак / Diclofenac	0,051 ± 0,006*	0,0005 (- 43%)
3b	0,074 ± 0,006	0,08 (-18%)
3n	0,054 ± 0,008*	0,003 (-40%)

*статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой / *statistical significance in comparison with the control group

По результатам скрининговых исследований были выбраны соединения 3b и 3n. Для этих соединений проводились исследования на 4 группах животных, состоящих из 8 особей в каждой. В первой серии исследуемые вещества вводили разово за час до инъекции формалина (профилактическое введение). Результаты представлены в таблице 3. Во второй серии исследуемые вещества вводили ежедневно в течение 5 суток (терапевтическое введение). Результаты представлены в таблице 4. В качестве референтного средства использовали диклофенак.

Изучение соединений на модели формалин-индуцированного острого экссудативного воспаления показало, что соединение 3b при профилактическом введении снижает развитие отёка на 31%, а соединение 3n — на 39% по сравнению с контрольной группой. Полученный эффект сопоставим с действием диклофенака, снижающего прирост повреждённой лапки на 40%.

При курсовом применении исследуемых субстанций на пятые сутки эксперимента прирост массы лапки в группе животных, получавших соединение 3b, снизился на 18%, в группе, получавшей

3n, — на 40%, в группе, получавшей диклофенак, — на 43% относительно контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Соединения под лабораторным шифром 3b и 3n демонстрируют наличие противовоспалительной активности на модели формалинового отёка. Соединение 3n является наиболее перспективным для дальнейшего исследования, так как его действие сопоставимо с препаратом сравнения диклофенаком.

Финансирование: Авторы заявляют об отсутствии финансирования.