Инновационные технологии функциональных продуктов с применением высокого давления для сохранения нативной структуры белков

За последние два десятилетия обработка высоким давлением была показана в качестве способа сохранения продуктов от микробиологической порчи, однако отмечается и изменение физических и функциональных свойств пищевых систем [1, 2]. Контроль температуры процесса обработки высоким давлением является важным фактором, влияющим на изменение ряда свойств продуктов, включающих стабильность белка, жира, переход в гель или кристаллическое состояние, а также на равномерное распределение давления в целях инактивации нежелательных микробов и ферментов [3].

Конструкция аппарата высокого давления включает в себя сосуд высокого давления, нагнетательную систему – насос гидростатического давления или интенсификаторы высокого давления, устройство для нагрева/охлаждения и хранения продукта [4, 5]. В аппарате высокого давления происходит изменение физических свойств воды, например, объем воды под действием высокого давления уменьшается до 4 % при 100 МПа или до 15 % при 600 МПа [6].

Для оценки процесса денатурации белков под действием высокого давления была предложена фазовая диаграмма «давление –температура» (Р-Т) [7], которая позволяет определить область давления и температуры, в которой нативная структура белка не меняется (рисунок 1).

Рисунок 1. Общая схема фазовой диаграммы «давление- температура»

Одним из практических применений Р-Т диаграммы является понимание стабилизации пищевых систем, а также денатурации белка под воздействием тепла или высокого давления [6]. Зона I является областью, в которой денатурация белка происходит при более низких давлениях и низких температурах. Зона II - это область ниже максимальной температуры перехода, в которой происходит денатурация белка при низких температурах с использованием более высоких давлений. Зона III характеризует область высоких температур, в которой происходит денатурация при увеличении давления [7]. Таким образом, Р-Т диаграмма иллюстрирует режимы, при которых будет происходить потеря нативной структуры белка или ферментативной активности. Литературные данные свидетельствуют, что обработка под высоким давлением при низкой температуре представляет ин- терес для пищевой промышленности в связи с высокой микробной инактивацией и сохранением большей части нативных физико-химических и органолептических свойств продукта [8].

Исследователи подразделяют функциональные свойства пищевых белков на три основные группы [7, 9]: свойства гидратации, адгезии, растворимости, вязкости, дисперсности, водопоглощения; межфазные свойства, включающие поверхностное натяжение, эмульгирование и пенообразующие характеристики; свойства агрегации и гелеобразования. Улучшение функциональных свойств белков, по мнению авторов [10], может быть достигнуто путем модификации структуры белка химическими или ферментативными методами, а также с помощью физической обработки. Исходные свойства обрабатываемой системы, включающие концентрацию белка, рН, активность воды, температуру и высокое давление, влияют на степень модификации белковой молекулы. Увеличение давления и времени, как правило, приводит к большим изменениям в структуре белков [11].

Денатурация белка под действием высокого давления представляет собой сложный процесс, который в первую очередь приводит к образованию водородных и нарушению гидрофобных связей, а также к увеличению электростатического взаимодействия внутри молекулы [7, 10]. Наиболее слабые нековалентные связи между аминокислотными остатками, поддерживающие третичную структуру белка, сначала дестабилизируются при высоком давлении, а затем заменяются на гидрофильные связи [12]. Увеличение гидростатического давления приводит к проникновению молекул воды во внутреннее пространство белка, постепенно заполняя «пустоты», что, в конечном счете, разрушает структуру молекулы белков. Помимо этого, высокое давление влияет на нековалентные взаимодействия внутри белковой молекулы с последующим повторным образованием внутри- и межмолекулярных связей, а также между молекулами белка. Известно, что для разрушения одной дисульфидной группы белковой молекулы требуется около 50,9 ккал/моль, в то время как энергия 81,1 ккал/моль и 98,8 ккал/моль дестабилизирует –SH- и –CH - группы, соответственно [13]. Отмечено, водородные связи в меньшей степени чувствительны к давлению, что приводит к сохранению вторичной структуры белка.

На протяжении последних лет были проведены исследования по влиянию высокого давления на эмульгирующие и пенообразующие свойства глобулярных белков. Результаты подтверждают, что происходит снижение эффективности эмульгирования β-лактоглобулина после обработки высоким давлением по сравнению с эмульсиями, образованными нативным белком [9]. Ряд авторов считает, что изменение эмульгирующей способности β-лактоглобулина под действием высокого давления зависит от концентрации белка в системе, обосновывая это тем, что образцы с высоким содержанием белка (1,5 мг/мл) не показали изменение функциональных свойств [14].

Исследования влияния высокого давления на свойства эмульгирующей и гелеобразующей способности показали, что высокое давление до 300 МПа не влияет на эмульгирующую способность белков плазмы крови, в то время как давление выше 400 МПа приводит к изменению рН. Например, при рН 6,5, высокое давление в 400 МПа повышало эмульгирующие свойства белков плазмы крови, не влияя при этом на гелеобразующие свойства. Однако при понижении кислотности до рН 5,5 и повышении давления наблюдалось ухудшение эмульгирующей способности белков крови вместе с существенными изменениями в текстуре.

Влияние высокого давления на пенообразующие свойства молочных белков описано с позиции получения новых текстур путем образования молочных гелей и эмульсий. Пенообразующие свойства сывороточного белка улучшаются при рН (6,0-7,0) в связи с увеличением гидрофобности белка при обработке высоким давлением [10]. Известно, что стабильность пены β-казеина, полученной при давлении 300 МПа, повышается, по сравнению со свойствами пены нативного β-казеина. Однако обработка давлением до 900 МПа в течение 30 мин приводит к существенному изменению структуры β-казеина, что сопровождается ухудшением функциональных свойств данных белков [14]. Некоторые белки претерпевают обратимые изменения при давлении 100—200 МПа, в то время как более высокое давление (> 200 МПа) вызывает необратимые изменения в структуре белковой молекулы. Таким образом, изменения функциональных свойств белков после применения высокого давления зависят от целого ряда факторов, включающих начальный уровень давления, температуру и время обработки, тип белка, концентрацию в системе, рН и ионную силу [7, 10].

Учитывая, что высокое давление является инновационной нетермической технологией, позволяющей получать пищевые продукты с улучшенной функциональностью, нами были проведены исследования по влиянию высокого давления на свойства глобулярных белков в системах с относительно низким содержанием сухих веществ (<10 %). В литературе до настоящего времени отсутствует молекулярное понимание структурных и функциональных свойств конденсированных глобулярных белков под действием высокого давления. Таким образом, цель настоящей работы — оценить влияние высокого давления на вторичную конформацию глобулярных белков при более высоких концентрациях. Это, в первую очередь, позволит определить степень изменения вторичной структуры, связанной с частичной или полной денатурацией. На основании анализа априорной информации по применению высокого давления [1-4, 6, 11, 12, 17], параметров обработки аналогичных белковых систем, в т.ч. глобулярных белков [7-10, 13, 14, 16], а также с учетом предварительных исследований высококонцентрированных белковых композиций [15, 18, 19] нами были выбраны следующие технологические параметры: давление (600 ± 0,2) МПа; продолжительность обработки (15±1) мин; температура обработки (22±2) °С.

В качестве функциональной белковой составляющей нами выбраны сывороточные белки, которые содержат биологически активные компоненты — иммуноглобулины, обладающие защитным эффектом против инфекционных заболеваний [15]. По сравнению с синтетическими и полусинтетическими антибиотиками, иммуноглобулины имеют более низкую стоимость, но самое главное, — они обладают высокой эффективностью, основанной на поликлональной конформации и минимальном влиянии на микрофлору кишечника человека.

Поэтому, включение иммуноглобулинов в пищевые продукты и нутрицевтики требует понимания механизмов взаимодействия и устойчивости к различным условиям обработки, которые используются в пищевой промышленности.

Было изучено влияние высокого гидростатического давления на структурные свойства конденсированных образцов иммуноглобулинов (>60 %). Температура денатурации белка контролировалась с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Были подготовлены две аналогичные серии образцов систем иммуноглобулинов. Образцы, не прошедшие обработку высоким давлением, показывали типичные эндотермические пики при нагревании от 35 до 95 °С со скоро- стью 2 °С/мин [16] (рис. 2). Для сравнения на рисунке 2 показаны термограммы и для образцов систем иммуноглобулинов, обработанных высоким давлением (концентрация от 60 до 80 %), на которых видны четкие эндотермические пики. По нашему мнению, данное явление характеризует сохранение вторичной конформации белковой молекулы, обработанной высоким давлением. Устойчивость к высокому давлению может быть объяснена отсутствием свободных SH-групп, что вероятно инициирует молекулярные перегруппировки [17], а также относительно высокой молекулярной массой иммуноглобулинов.

Рисунок 2. ДСК-термограммы 60 ( □■ ), 70 ( О* ) и 80 % ( △▲ ) образцов иммуноглобулинов при нагревании от 35 до 90 °С со скоростью 2 °С / мин при атмосферном давлении (открытые символы) и при высоком давлении 600 МПа в течение 15 мин (закрытые символы)

Устойчивость к высокому давлению сывороточного альбумина коррелируется с наличием 17 дисульфидных связей, которые стабилизируют его трехмерную структуру [13]. Степень денатурации белка была оценена с учетом измерения температуры денатурации и оценки вторичной конформации методом ИК-спектроскопии [18, 19].

Из рисунка 3 видно, что в обоих случаях имеются четко определенные пики денатурации, но с некоторыми изменениями в размере и диапазоне температур, отражающих основные характеристики эндотермического процесса. В целом, обработка высоким давлением проявляла частичный эффект на морфологию и вторичную структуру сывороточного альбумина.

Рисунок 3. Изменение оптической плотности в зависимости от концентрации образцов, испытанных при атмосферном давлении (А), после обработки при 600 МПа в течение 15 мин ( ▲ ) и после термической обработки при 85 °С в течение 20 мин ( О ) в ИК-спектроскопии.

Экспериментальные наблюдения показали, что иммуноглобулины и сывороточный альбумин сохраняют вторичную структуру при воздействии высокого давления. Было высказано предположение, что данное явление связано с отсутствием свободных SH-групп, и относительно высокой молекулярной массой иммуноглобулина, тогда как стабильность к высокому давлению сывороточного альбумина обусловлено наличием 17 дисульфидных групп в молекуле.

Таким образом, проведенные исследования показывают перспективы в создании инновационных функциональных продуктов за счет обработки высоким давлением сывороточных белков, которые потом используются в качестве замены термически обработанных концентратов и изолятов. Сывороточные белки, обработанные высоким давлением, использованы для модификации технологических и сенсорных свойств молочных продуктов (молока питьевого, кисломолочных напитков, десертов), а также при экспериментальных выработках сухих завтраков, каш и батончиков.