Инновационный метод окрашивания клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями

Введение. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной инструментальной биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания тканей, клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов. Актуальным подходом к решению указанных задач является введение в молекулы родаминов новых компактных фоточувствительных групп, а именно тиоамидных и N –нитрозотиоамидных. Это дает возможность синтезировать ФФК вначале в так называемой «закрытой» (или «cпиросочлененной») бесцветной форме и способствует повышению их мембранной проницаемости [1-3]. Облучение светом с длиной волны ≥ 375 нм вызывает раскрытие пятичленного цикла и регенерирует окрашенную флуоресцентную форму. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно легко варьировать число и пространственное расположение вновь образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение клеточных и субклеточных объектов, помеченных этими (поначалу «замаскированными») красителями [1-3].

Целью данной работы являлось исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК) – производных родамина, проникающих через клеточную мембрану и обеспечивающих возможность окрашивания клеток.

Экспериментальная часть. Различные соединения типа ФФК были синтезированы под руководством В.Н. Белова и сотрудниками [4]. В данной работе представлен только один из новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей – ФФК-813, все детали синтеза и характеристика которого уже опубликованы [4].

Отработку метода окрашивания проводили на линии клеток кератиноцитов человека (HaCaT), предварительно выращенных в ячейках планшета на покровных стеклах.

Кристаллический ФФК-813 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и помещали на 1 час в ультразвуковую ванну. Это необходимо для разрушения агрегатов красителя. Полученный раствор (2 мг/мл) разводили в воде до концентрации 200 мкг/мл, и затем добавляли в ячейку. Конечная концентрация, с учетом питательной среды в ячейке, составила 2,5 мкг/мл. Планшеты с клетками поместили в инкубатор с заданным режимом работы (Т=37^оС, ϕ (CO 2 ) = 4,5%) на 15 мин.

По истечении времени инкубации, добавили ядерный краситель «Хёхст», после чего также инкубировали 15 минут. Затем в ячейку добавили 1 мл 4%-го (до 1 %) раствора формальдегида, для фиксирования клеток, инкубировали 15 минут. Далее, полученный раствор декантировали и промывали ячейку два раза 3 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в течение 5 минут (оставили ФСБ после второй промывки в ячейке).

На предметное стекло, нанесли каплю мовиола (полимеризующий агент). После этого, вытащили с помощью иглы и пинцета из лунки покровное стекло, и положили на предметное стекло таким образом, чтобы монослой клеток был между стеклами, склеенный мовиолом. Надавливая сверху иглой, фиксировали плотней покровное стекло, чтобы между стеклами не было пузырьков с воздухом.

Результаты и обсуждения. На конфокальном инвертированном микроскопе «Eclipse TE2000» фирмы Nikon микроскопировали полученный препарат монослоя клеток. Была изучена клеточная линия кератиноцитов человека HaCaT.

1. Клетки окрашены ФФК-813, конц. 2,5 мкг/мл, увеличение 1000× (слева) и увеличение 3000× (справа).

Выбрано оптимальное соединение и изучено связывание ФФК с клетками. При использовании раствора ФФК-813 в концентрации 2,5 мкг/мл наблюдается окрашивание внутриклеточных структур клеток НаСаТ (рис. 1, красные «диффузные» области) в сравнении с традиционным красителем «Хёхст», окрашивающим ядра клеток (рис. 1, синие окружности).

Как видно из рисунка 1, краситель ФФК-813 в концентрации 2,5 мкг/мл достаточно хорошо окрашивает монослой клеток. Интенсивная флуоресценция на увеличенном фрагменте справа указывает на верно подобранную концентрацию красителя.

Для расшифровки процесса связывания ФФК с клетками и его транспорта через клеточную мембрану, начаты работы по компьютерному моделированию связывания ФФК-813 с липидными компонентами клеточных мембран методом молекулярной динамики.

Получены данные по моделированию структуры ФФК-813, фосфолипидов и их бислоев для моделирования биомембран. Работа проводится на базе операционной среды UNIX, с помощью программ «Maestro» (Schrödinger), «VMD», и «GROMACS» [5,6].

В ходе работы было построено несколько небольших моделей липидных бислоев индивидуального и смешанного состава, содержащих от 32 до 40 молекул фосфолипидов (рис. 2). Использовались структуры ДОФХ (диолеоилфосфохолин), ДОФС-Na (натриевая соль диолеоилфосфосерина), ПОФЭ (1-пальмитоил-2-олеоил-фосфоэтаноламин), ПОФХ (1-пальмитоил-2-олеоилфосфохолин), ДМФХ (димиристоилфосфохолин), ДМФС-Na (натриевая соль димиристоилфосфосерина). Так, были построены следующие бислои в водном окружении: ДОФХ, ДОФС-Na, ДОФХ/ДОФС-Na (3:5), ПОФХ/ПОФЭ (2:1), ДМФХ/ДМФС-Na (1:1).

На рисунке 2 представлена модель липидного бислоя на основе ДОФХ/ДОФС-Na. Система в целом электронейтральна и содержит 12 молекулы ДОФХ, 20 молекул ДОФС, 20 ионов Na+ и 942 молекулы воды.

2. Бислой ДОФХ/ДОФС-Na через 10 нс.

Динамика проводилась в течение 10 нс, при нагревании до 300К и семиизотропном давлении.

Уровень энергии установлен на постоянном уровне, что свидетельствует о стабилизации системы.

Красно-белым цветом показаны диполи воды, зеленым – «хвосты» молекул липидов ДОФХ и ДОФС, синим цветом – катионы Nа+, связанные с отрицательно заряженным остатком серина ДОФС.

В настоящее время проводится оптимизация параметров запуска молекулярной динамики в «GROMACS» для исследуемых ФФК, встраивание ФФК-813 в модельный бислой ПОФХ, а также анализ взаимодействия его функциональных групп с фосфолипидом и изменений, вызываемых в мембране в результате связывания.

Таким образом, отработан метод окрашивания клеток на линии клеток кератиноцитов человека (HaCaT). Подобрана оптимальная концентрация красителя ФФК-813 для равномерного окрашивания монослоя клеток (2,5 мкг/мл). Изучено связывание ФФК-813 с клетками и внутриклеточными структурами на линии клеток кератиноцитов человека (HaCaT). Получены данные по моделированию биомембран, которые позволят выяснить механизмы взаимодействия ФФК-813 с плазматической мембраной.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Paul, P.H. Imaging of Pressure- and Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. / P.H. Paul, M.G. Garguilo, D.J. Rakestraw // Anal. Chem. – 1998. – V. 70 . P. 2459–2467. 2. Molho, J.I. Optimization of Turn Geometries for Microchip Electrophoresis. / J.I. Molho, A.E. Herr, B.P. Mosier, J.G. Santiago, T.W. Kenny, R.A. Brennen, G. Gordon, B. Mohammadi // Anal. Chem. – 2001. – V. 73 . P. 1350–1360. 3. Willis, R.C. Portraits of Life: One Molecule at a Time. / R.C. Willis // Anal. Chem. – 2007. – V. 79 . P. 1785–1788. 4. Boyarskiy V.P. Photostable, Amino Reactive and Water-Soluble Fluorescent Labels Based on Sulfonated Rhodamine with a Rigidized Xanthene Fragment / V.P. Boyarskiy, V.N. Belov, R. Medda, B. Hein, M. Bossi, S.W. Hell // Chem. Eur. J. 2008, 14,1784 – 1792. 5. Lindahl E., Hess B., van der Spoel D. 2001. GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., 7, 306–317. 6. Berendsen H. J. C., van der Spoel D., van Drunen R. 1995. A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Comp. Phys. Comm., 91, 43–56.

ИННОВАЦИОННЫЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ КЛЕТОК НОВЫМИ ФОТОАКТИВИРУЕМЫМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

Шапошников М.Н., Бартов М.С., Зайцев С.Ю.

Резюме

Методом флуоресцентной микроскопии показано окрашивание внутриклеточных структур клеток кератиноцитов человека линии НаСаТ новым фотоактивируемым флуоресцентным красителем – ФФК813. Получены предварительные данные по компьютерному моделированию структуры и динамики биоорганических молекул и их слоев для моделирования биомембран.

INNOVATIVE METHODS OF CELL STAINING NEW PHOTOACTIVATABLE FLUORESCENT DYES

Shaposhnikov, M.N., Barto M.S., Zaitsev S.Y.