Интеграция и экспрессия маркерных генов в эмбрионах кур при использовании ретровирусных экспрессирующих векторов

Изучение биологических основ создания трансгенных форм остается актуальной задачей современной науки. Трансгенез признается неотъемлемой частью биотехнологий будущего, сориентированных на решение широкого спектра задач фундаментального и прикладного характера. Одно из перспективных направлений в этой области — получение трансгенных кур-биореакторов (1-6).

Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими обусловливают явное преимущество использования первых в качестве продуктивной платформы при производстве рекомбинантных белков со сложной структурой: птицы иммуноустойчивы к потенциальным терапевтическим протеинам (например, к эритропоэтину человека), экспрессия которых может негативно влиять на состояние здоровья трансгенных млекопитающих, продуцирующих подобные лекарства на коммерческом уровне. К тому же при применении трансгенной птицы в качестве продуктивной платформы значительно снижается стоимость получаемых протеинов по сравнению с таковой при микробиологической ферментации Escherichia coh , дрожжей или культивировании клеток млекопитающих (7).

Вместе с тем, традиционный метод получения трансгенных животных (микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот) при трансгенезе птицы малоэффективен, что требует поиска и разработки альтернативных приемов переноса экзогенной ДНК, к числу которых относится использование генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов. Возможность адресной доставки экзогенных генов в делящиеся клетки делает применение подобных векторов особенно актуальным в случае трансформации эмбриональных клеток птицы, в частности кур, так как к снесению яйца эмбрион уже находится на стадии 50-60 тыс. клеток.

В этой связи целью нашей работы было изучение эффективности переноса рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур in vivo с использованием различных ретровирусных экспрессирующих векторов в рамках поэтапной разработки и оптимизации технологии создания трансгенной птицы.

Методика . Для трансформации эмбрионов кур использовали две генные конструкции — pLgfpSN и pLNCgfp, полученные соответственно на основе векторов pLXSN и pLNCX (8). Конструкции содержали следующие цис-действующие элемены ретровирусного генома: 5 ‘ - и 3 ‘ -LTR (U3-R-U5); сайт связывания т-РНК затравки (PBS, primer binding site, сайт инициации синтеза минус-цепи ДНК); ^ -область, а также часть гена gag (последовательности, ответственные за упаковку и димеризацию вирусных РНК); sd (splice donor, донорный сайт сплайсинга); полипуриновый тракт (PPT, polypurine tract, сайт инициации синтеза плюс-цепи ДНК). Для селективного введения в клетки пакующей линии в конструкции был интегрирован ген устойчивости к химическому аналогу неомицина G418 ( neo ), контроль транскрипции которого осуществлялся либо с ретровирусного LTR (pLNCgfp), либо с промотора ранних генов вируса SV40 (pLgfpSN). В генной конструкции pLgfpSN маркерный ген GFP был поставлен под контроль промотора Mo-MuLV, в конструкции pLNCgfp — под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV-IE). Для упаковки ретровирусных векторов применяли две пакующие линии — GP + envAM12 и PT67 (9, 10). Обе линии были получены на базе мышиных фибробластов NIH 3T3 и различались типом продуцируемых env-белков, ответственных за распознавание поверхностных рецепторов на клетках-мишенях.

В качестве источника генных конструкций использовали вирусный препарат с титром 9Х105 КОЕ/мл. Конструкции вводили в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов кур (2 мкл на эмбрион) при помощи капиллярной микропипетки Transferpetor («Sigma», США). Эффективность введения ретровирусных векторов изучали на 5- и 15-суточных эмбрионах. Результативность трансформации эмбрионов кур определяли по наличию и экспрессии гена GFP. Наличие гена GFP выявляли методом полимеразной цепной реакции с использованием ДНК, выделенной из эмбрионов солевым методом (11). Экспрессию GFP оценивали на криостатных срезах тканей, полученных от эмбрионов, по наличию специфической флуоресценции (микроскоп фирмы «Nikon», Япония; фильтр 480-490 нм). Крио-статные срезы готовили по общепринятой методике (12).

Результаты . Эффективность трансформации эмбрионов варьировала в зависимости от используемой генной конструкции и пакующей линии клеток. Минимальное влияние на эмбриогенез кур было установлено в вариантах с генными конструкциями, помещенными в пакующую линию рТ67: развитие эмбрионов наблюдалось в 70-73 % случаев. При введении в эмбрионы кур генных конструкций, упакованных в клеточную линию GP + envAM12, эмбриональная смертность оказалась на 3-13 % выше (табл. 1). Значительных различий по влиянию на эмбриогенез кур в зависимости от используемой генной конструкции мы не установили.

1. Эффективность введения ретровирусных векторов pLNCgfp и pLgfpSN в эмбрионы кур in vivo при использовании разных линий клеток-упаковщиц

Примечание. Метод введения вирусного препарата, содержащего конструкцию, — в дорсальную аорту. Частоту интеграции (%) определяли как отношение числа полученных трансгенных эмбрионов к числу развившихся, эффективность трансгенеза (%) — как отношение числа полученных эмбрионов к числу инъецированных.

Высокую результативность генетической трансформации эмбрионов кур выявили при использовании генной конструкции pLNCgfp: доля трансформированных эмбрионов от общего числа инъецированных достигала 46,7 %. В варианте с генной конструкции pLgfpSN этот показатель был на 13,3-37,6 % ниже и варьировал от 9,1 до 33,4 %.

Использование пакующей линии GP + envAM12 позволило повысить частоту интеграции рекомбинантной ДНК и эффективность трансгенеза на 2,8-13,3 % по сравнению с показателем в случае линии рТ67.

Оценивая эффективность переноса рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур на 5-е и 15-е сут развития, следует отметить снижение доли трансгенных эмбрионов с увеличением срока инкубации. Так, при введении генной конструкции pLNCgfp процент трансгенных эмбрионов от общего числа проинъецированных составил на 5-е сут 46,7 %, на 15-е сут — 18,8 %. Аналогичную тенденцию отмечали и при использовании генной конструкции pLgfpSN: к 15-м сут по сравнению с 5-ми сут анализируемый показатель сократился на 20,9-21,5 % в зависимости от используемой линии клеток-упаковщиц. Снижение доли трансгенных эмбрионов с увеличением срока инкубации свидетельствует о влиянии экспрессии трансгена на эмбриогенез.

Топографический анализ паттернов интеграции показал, что наибольший процент трансформированных органов и тканей наблюдался при введении в эмбрионы кур генной конструкции pLNCgfp и пакующей линии GP + envAM12 — 42 % (табл. 2). Экспрессия репортерного белка была выявлена преимущественно в клетках печени, сердца и в мышечной ткани. При использовании генной конструкции pLgfpSN и пакующей линии рТ67 результативность трансформации органов и тканей оказалась на 11 % ниже и равнялась 31 %.

2. Топография генетической трансформации in vivo у 15-суточных эмбрионов кур при введении ретровирусных векторов pLNCgfp и pLgfpSN с использованием разных линий клеток-упаковщиц

Экспрессию гена GFP в органах и тканях у 5- и 15-суточных эмбрионов кур иллюстрирует рисунок (см. вклейку).

Таким образом, эксперименты по переносу рекомбинантной ДНК в эмбрионы in vivo показали перспективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации эмбриональных клеток кур и получения трансгенных особей. Высокая эффективность трансгенеза (18,8 %) установлена при использовании генной конструкции pLNCgfp и пакующей линии GP + envAM12.