Интерфероновый статус у больных гриппом и другими острыми респираторными вирусными инфекциями

Одними из важнейших цитокинов воспаления являются интерфероны (IFN), осуществляющие врожденную неспецифическую локальную и системную реакции организма в ответ на внедрение и репликацию вирусов. Стимуляторы интерферонов интерлейкин-18 (IL-18) и др. – участие в воспалении принимают не прямо, а путем усиления выработки IFN. Все цитокины входят в состав биологической мультисистемы “цитокиновой сети”, осуществляющей межклеточные взаимодействия с поддержанием клеточного гомеостаза на неизменном уровне [2, 3].

Противовирусное действие IFN- α заключается в подавлении репликации вирусов на ранней стадии болезни. Функция IFN- α состоит в мощной активации макрофагов, NK-клеток и подавлении пролиферации В-лимфо-цитов. Также IFN- α определяет дифференцировку Т-хелперов на Th-1 [2]. Повышение уровня IFN- α в остром периоде заболевания со снижением до нормы в периоде реконвалесценции характеризует патогенез многих вирусных инфекций.

Продукция IFN- γ , как и IFN- α , может осуществляться практически всеми клетками человеческого организма, но чаще – активированными Th1-лимфоцитами, В-лим-фоцитами, NK-клетками, макрофагами. IFN- γ активирует моноциты/макрофаги, NK-клетки, Т- и В-лимфоциты, усиливая их цитотоксичность, продукцию молекул адгезии и других цитокинов [3].

Результаты изучения уровня IFN-γ у больных ОРВИ противоречивы. Так, повышенный уровень IFN-γ был обнаружен в носоглоточной слизи детей с тяжелым течением респираторно-синцитиальной вирусной инфекции (РС-инфекции) [5]. Было определено отсутствие достоверных различий концентрации IFN-γ с контролем, как при среднетяжелом, так и тяжелом течении гриппа pH1N1 [7]. В другом исследовании были выявлены нормальные показатели концентрации IFN-γ в периферической кро- ви больных среднетяжелой формой гриппа pH1N1, однако отмечалось достоверное повышение его уровня при тяжелом течении, в связи с чем авторы посчитали повышенный уровень IFN-γ маркером тяжелого течения гриппа pH1N1 [6].

Как и IFN, интерлейкин-18 по структуре представляет собой белок, который продуцируют, прежде всего, активированные макрофаги в зоне воспаления. Уcтановлена координирующая роль провоспалительного IL-18 в качестве дополнительного стимулятора продукции интерферонов (прежде всего IFN- γ ). Помимо этого, IL-18 в синергизме с интерлейкином-12 (IL-12) и IFN ( α и β ) способен вызывать продукцию других провоспалительных цитокинов Th1-лимфоцитами, которые, в свою очередь, могут привести к разрушению тканей путем излишней стимуляции выработки макрофагами TNF- α , свободных радикалов кислорода и окиси азота.

В доступной нам литературе мы не встретили работ, исследующих полный интерфероновый статус (IFN и IL-18) у больных ОРВИ. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы явилось исследование уровня IFN и его стимулятора IL-18 у больных ОРВИ, вызванных респираторными вирусами, наиболее часто встречающимися в популяции, на разных этапах заболевания.

Материал и методы

Обследовано 85 больных средней тяжести в возрасте 15–54 лет: гриппом pH1N1 (n=18), гриппом А/H3N2 (n=17), аденовирусной инфекцией (n=17), парагриппом (n=20) и РС-инфекцией (n=13). Отдельную группу (n=10) составили больные с тяжелым течением гриппа pH1N1 с летальным исходом в возрасте 19–61 лет. Кровь забирали в остром периоде (1–2-й день болезни) и в периоде реконвалесценции (на 7–9-й день болезни). Диагноз был подтвержден с помощью метода полимеразной цепной реакции или реакции непрямой гемагглютинации (выявлением специфических антител с ростом их титра в 4

Таблица

Сравнительная характеристика концентрации цитокинов у больных ОРВИ

Группы больных ОРВИ в зависимости от этиологии		Медиана (диапазон значений), пг/мл; n – число обследованных пациентов
Период		Острый период	Реконвалесценция
Грипп pH1N1 (среднетяжелое течение)	IFN-α	13,2 (0–82,6)?, n=17	2,1 (0–13,7)*, n=17
	IFN-γ	1,1 (0–39,1)**?, n=17	0,2 (0–15,9)*?, n=16
	IL-18	618,6 (165,5–1000), n=15	433,6 (132,2–1000), n=14
Грипп pH1N1 (тяжелое течение /умершие/)	IFN-α	8,6 (0–500)?, n=10	-
	IFN-γ	1,3 (0–128,4)?, n=10	-
	IL-18	523,9 (114,9–1000)?, n=10	-
Грипп A/H3N2	IFN-α	0,6 (0–31,1)**, n=14	1,4 (0–19,5), n=13
	IFN-γ	8,7 (0–48,9)?, n=13	6,3 (0–11,4)?, n=13
	IL-18	266,9 (95,2–886,8), n=16	284,2 (98,3–373,1), n=13
Аденовирусная инфекция	IFN-α	5,8 (0–148), n=17	2,95 (0–51,6), n=12
	IFN-γ	0,1 (0–111,9)**?, n=17	0,3 (0–12,8)*?, n=12
	IL-18	267,1 (50,5–1000), n=17	361,8 (64,6–1000), n=12
Парагрипп	IFN-α	9 (0–193,7)?, n=18	2,3 (0–44,9), n=16
	IFN-γ	5,1 (0–66,6)?, n=19	5,3 (0–11,8)?, n=16
	IL-18	394,2 (87,2–1000), n=19	203,8 (106,9–1000)*, n=16
РС-инфекция	IFN-α	4,9 (0,2–49)?, n=12	2,7 (0–11,7), n=13
	IFN-γ	8,3 (0–97,9)?, n=12	3,7 (0–17,6)?, n=13
	IL-18	523,4 (149,3–942,6), n=13	291,2 (85,1–903,4), n=13
Контроль, пг/мл	IFN-α	0,9 (0–8,6), n=16
	IFN-γ	0,1 (0–10,6), n=17
	IL-18	263,8 (13,7–1000), n=17

Примечание: * – достоверные различия показателей в динамике заболевания (р<0,05). ** – достоверные различия между группой больных с тяжелым течением гриппа pH1N1 и другими ОРВИ, находящимися в остром периоде заболевания (р<0,05). ? – достоверное отличие от контроля (р<0,05).

и более раз). Уровень цитокинов определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа коммерческими тест-системами ЗАО “Вектор-Бест”, Россия.

Результаты клинических и лабораторных исследований были внесены в специально разработанные карты индивидуального обследования пациентов с последующим представлением в виде электронных таблиц Microsoft Excel 2007. Статистическая обработка результатов исследований была проведена с использованием пакета StatGraphics 15.0. Нормальность распределения вариационных рядов (соответствие закону Гаусса) проверяли с помощью критериев согласия Колмогорова– Смирнова и Шапиро–Вилкоксона, одного из самых мощных критериев нормальности. При проверке гипотезы нормальности распределения в качестве точечной оценки характеристики центра группирования значений случайной величины использовали выборочное среднее (Mo) [1]. В случае нормального распределения каждой из выборок межгрупповые различия выявляли при помощи t-критерия Стьюдента (СТ) и точного критерия Фишера для сравнения дисперсий (φ). При несоблюдении нормальности распределения в качестве точечной оценки характеристики центра группирования значений случайной величины использовали медиану (Ме) – показатель, наименее подверженный влиянию со стороны индивидуальных колебаний признака. Между собой выборки сравнивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона–Манна–Уитни (ВМУ) – рангового критерия, хорошо приспособленного для анализа малых выборок и робастного к виду закона их распределения, а также двухвыборочного критерия Колмогорова–Смирнова (КС) [1]. Уровень значимости при проверке всех статистичес- ких гипотез – р<0,05 (доверительная вероятность >0,95).

Контролем служила кровь 17 здоровых доноров в возрасте 19–40 лет (IFN- α –Ме=0,85 пг/мл, IFN- γ –Ме= =0,1 пг/мл, IL-18–Me=263,8 пг/мл). Полученные нами значения цитокинов контрольной группы лиц согласуются со средними показателями, полученными при обследовании сыворотки крови 68 здоровых доноров фирмой-производителем тест-систем “Вектор-Бест”: IFN- α – значения, не превышающие 5 пг/мл, IFN- γ – 2 пг/мл (с вариацией от 0 до 10 пг/мл), IL-18 – 370 пг/мл (с вариацией от 104 до 650 пг/мл).

Результаты

Отмечено повышение концентрации IFN- α в остром периоде большинства ОРВИ: среднетяжелого (р<0,001) и тяжелого течения гриппа pH1N1 (р=0,011), парагриппа (р=0,022, р=0,011, p=0,012), РС-инфекции (р=0,027, р=0,003, р=0,013). Похожая тенденция выявлена и в остром периоде аденовирусной инфекции, но она не носила достоверного характера (р=0,055) (таблица).

Достоверных отличий концентрации IFN- α у больных с тяжелым течением гриппа pH1N1 в сравнении с его среднетяжелым течением (острым периодом) определено не было, однако уровень IFN- α статистически значимо был выше у каждой из указанных двух выборок в сравнении с соответствующим периодом среднетяжелого течения гриппа A/H3N2 (р<0,05).

У всех групп больных ОРВИ к периоду реконвалес-ценции уровень IFN-α, в сравнении с контролем, был нормализован (р>0,05), что характерно для провоспали-тельных цитокинов, активно участвующих в начальной стадии инфекционного процесса.

Выявлено достоверное повышение концентрации IFN- γ в остром периоде и в периоде реконвалесценции у больных всех обследуемых групп (р<0,05). Уровень IFN- γ в остром периоде у больных с тяжелым течением гриппа pH1N1 был достоверно выше, чем при среднетяжелом течении гриппа pH1N1 (р<0,001), а также аденовирусной инфекции (р=0,026).

В периоде реконвалесценции самый низкий статистически значимый уровень IFN- γ – хотя и больший по сравнению с контролем (р<0,001) – был у пациентов со среднетяжелым течением гриппа pH1N1 в сравнении с больными ОРВИ другой изученной нами этиологии (гриппом A/H3N2, аденовирусной инфекцией, парагриппом, РС-инфекцией), р<0,05.

Изменения IFN- γ в течение ОРВИ были разнонаправленными. Так, при гриппе pH1N1 было выявлено достоверное снижение концентрации IFN- γ к периоду рекон-валесценции (р<0,001), а при аденовирусной инфекции, наоборот, – повышение (р=0,015). При гриппе A/H3N2, парагриппе и РС-инфекции в течение всего периода заболевания была высокая концентрация IFN- γ , а ее изменения с течением времени не были достоверными (p>0,05).

Визуально высокие показатели уровня IL-18 – в сравнении с контролем – характеризовали острый период гриппа pH1N1, а также РС-инфекции (табл. 1). Так, самый высокий уровень отмечен у больных среднетяжелым течением гриппа pH1N1. Хотя он статистически значимо не отличался от нормы, но был достоверно выше, чем при гриппе A/H3N2 в остром периоде (р=0,024). Достоверным было только повышение уровня IL-18 у больных с тяжелым течением гриппа pH1N1 в сравнении с контролем (р=0,046), а также в сравнении с острым периодом гриппа A/H3N2 (р=0,017, р=0,011, р=0,029). Концентрация же IL-18 у других групп больных ОРВИ повышена не была.

В периоде реконвалесценции гриппа pH1N1 концентрация IL-18 оставалась на достаточно высоком уровне, но не прямо (в сравнении с контролем), а в сравнении с аналогичным периодом гриппа А/H3N2 (р=0,004, р=0,007, р=0,025) и парагриппа (р=0,028, р=0,008, р=0,021). Также в сравнении с реконвалесцентным периодом гриппа А/H3N2 (р=0,009, р=0,036) и парагриппа (р=0,003) концентрация IL-18 достоверно выше определялась и при аденовирусной инфекции. Таким образом, выявлено, что концентрация IL-18 в реконвалесцентном периоде гриппа pH1N1 и аденовирусной инфекции была более высокой в сравнении с тем же уровнем IL-18 при гриппе A/H3N2 и парагриппе.

Обсуждение

Известно, что повышенная продукция IFN (как -γ, так и -α) и их стимулятора IL-18 является универсальным защитным механизмом иммунной системы в ответ на внедрение и репликацию респираторного вируса (вне зависимости от его типа) [3]. Однако с течением времени изменение уровня данных регуляторных белков у больных ОРВИ изученной нами этиологии было различным, наиболее ярко проявляясь при гриппе pH1N1. Так, у боль- ных гриппом pH1N1 достоверно более высокий уровень IFN-γ был установлен при тяжелом течении с неблагоприятным исходом заболевания в сравнении с его среднетяжелым течением. Это, по видимому, свидетельствовало о более высокой активности клеток-продуцентов (Th1-лимфоцитов) и, наряду с другими цитокинами воспаления, являлось одной из причин, способствующей запуску деструктивных механизмов, альтерации и т.п., приводя в итоге к летальному исходу. Определяемая в исследовании более высокая концентрация IFN-γ у больных с тяжелым течением гриппа pH1N1 в сравнении со среднетяжелым, вероятно, может быть объяснена мощным синтезом IL-18 активированными макрофагами в зоне воспаления.

Таким образом, выявленное сочетание высокой концентрации IFN- γ и IL-18 при тяжелом течении гриппа pH1N1, характеризующимся бесконтрольным выбросом и других мощных цитокинов воспаления [6, 7], вносит свой “вклад” в процессы повреждения тканей и последующий летальный исход.

О значительной активации Th1-лимфоцитов при гриппе pH1N1 с относительным истощением компенсаторных возможностей клеток к реконвалесценции может свидетельствовать и самый низкий показатель IFN- γ (в сравнении с другими ОРВИ), определенный в реконва-лесценции.

В сравнении с IFN- γ изменение уровня IFN- α характеризовалось повышением в остром периоде большинства ОРВИ (р<0,05) с быстрым снижением его концентрации в периоде реконвалесценции. В связи с отсутствием статистически значимых различий уровня IFN- α между среднетяжелым и тяжелым течением гриппа pH1N1 (в отличие от IFN- γ и IL-18) можно предположить, что он играет несколько менее значимую роль при тяжелом течении гриппа pH1N1 по сравнению с IFN- γ .

Заключение

Установлено прогностическое значение высокого уровня IFN- γ и его стимулятора IL-18 в патогенезе тяжелого течения гриппа pH1N1. Для оценки состояния противовирусной защиты организма необходимо исследовать как IFN- α , так и IFN- γ и IL-18. Нами установлено, что наиболее информативными среди них являются IFN- γ и IL-18. В то же время динамика уровня IFN- α , характеризующаяся повышением в остром периоде и снижением в сыворотке крови к периоду реконвалесценции, свидетельствует о благоприятном течении ОРВИ. В связи с тем, что выявленное своеобразие изменения системы IFN, по нашему мнению, в какой-то мере характеризует патогенез каждой из форм ОРВИ, уровень исследуемых белков в крови был нами использован в виде одного из критериев в экспертной системе “Экспресс-диагностика и прогноз течения ОРВИ” [4].