Искусственное инфицирование растений горчицы сарептской возбудителем альтернариоза в лабораторных и полевых условиях

В последние годы увеличивается вредоносность некоторых болезней горчицы сарептской, ранее не имевших существенного значения. Вероятность их эпифитотийного развития повышается в связи с географической концентрацией культуры и возрастанием генетической однородности сортов.

Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний является альтернариоз, вызываемый грибами рода Alternaria . Болезнь поражает как вегетативные, так и генеративные органы растений, вызывая снижение урожая до 40-50 %, а также ухудшение посевных и товарных качеств семян.

В настоящее время отсутствуют сорта горчицы сарептской, устойчивые или толерантные к альтер-нариозу. Выявить селекционные образцы, способные сопротивляться поражению болезнью возможно в результате проведения искусственного инфицирования растений возбудителем болезни, создав благоприятные условия для развития патогена.

Из литературных источников известно о заражении растений пшеницы грибом Alternaria triticina суспензией конидий 1,6∙10⁴ кон./мл в тепличных условиях в разные фазы вегетации [5], растений амаранта грибом A. alternata суспензией конидий 1,0∙10⁷ спор в 1 мл рапсового масла в полевых условиях [2]. Сведений об оценке капустных культур, в частности горчицы сарептской, на устойчивость к альтернариозу в литературных источниках не обнаружено.

Цель и задачи исследований . Целью исследований явилось определение условий, необходимых для искусственного заражения растений горчицы сарептской грибом A. brassicicola в лабораторных и полевых условиях, а также камере искусственного климата, для проведения оценки сортов и сортообразцов на устойчивость к альтернариозу. В задачи исследований входило определение оптимального титра суспензии конидий и фрагментов мицелия патогена, диапазона температур и периода увлажнения для успешного процесса инокулирования проростков, а также фазы развития растений при проведении оценки в камере искусственного климата и полевых условиях.

Материал и методы . В качестве материала были использованы проростки и растения горчицы са-рептской перспективного сорта Росинка, так как в ходе исследований отмечено поражение альтернариозом растений данного сорта на 5,0-7,0% выше, чем других сортов.

Для инокулирования использовали изоляты гриба A. brassicicola , как наиболее патогенного вида рода Alternaria для растений горчицы.

Агрессивность патогена определяли по модифицированной нами методике P.A. Delwiche [4]. Проростки горчицы сарептской выращивали в лабораторных условиях в стерильном песке при температуре 2022 ^оС в течение 7 дней. Исследования проводили в двух вариантах: с механическим травмированием поверхности семядольных листьев стерильной иглой и без него, создавая условия влажной камеры. На каждую половину семядольных листьев капали суспензию конидий и фрагментов мицелия патогена с разной концентрацией – от 5,0∙10³ до 1,0∙10⁷ КОЕ/мл. Учеты проводили каждый день в течение 10 дней при температуре 20-22 ^оС. По данным наших исследований, эта температура окружающей среды является оптимальной для роста и развития гриба A. brassicicola . Критериями агрессивности служили инкубационный период болезни, количество пораженных семядолей и развитие болезни на семядолях.

Для определения условий внешней среды, при которых отмечают три этапа распространения болезни: начало процесса инфицирования растений горчицы сарептской грибом A. brassicicola , массовое проявление признаков альтернариоза и полное поражение растений, семядоли внешне здоровых проростков травмировали стерильной иглой и наносили на место укола суспензию конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл. Исследования проводили в термостатах при температурах 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ^оС, создавая условия влажной камеры. В качестве контроля – капли стерильной воды. Поражение проростков горчицы в условиях влажной камеры учитывали в течение 2-х суток.

В камере искусственного климата и полевых условиях инокуляцию горчицы сарептской возбудителем альтернариоза проводили в разные фазы развития растений, начиная с фазы розетки, по адаптированной нами для данной культуры и данного патогена методике Б. В. Квасникова [1] путем опрыскивания растений суспензией спор и конидий патогена (1,0∙107 КОЕ/мл) с помощью пульверизатора.

Результаты и обсуждение. Для успешного проведения искусственного инфицирования растений возбудителем болезни необходимы: восприимчивое растение, оптимальный титр суспензии спор и фрагментов мицелия патогена – КОЕ/мл (колониеобразующие единицы в 1 мл суспензии) и благоприятные условия окружающей среды для развития патогена – прежде всего температура и период увлажнения (рис. 1).

Рисунок 1 – Факторы, необходимые для успешного процесса инокулирования.

Изучение агрессивности гриба A. brassicicola , определение необходимого для инокулирования титра суспензии спор и фрагментов мицелия патогена проводили на проростках горчицы сарептской в лабораторных условиях. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Развитие альтернариоза на проростках горчицы сарептской в зависимости от титра суспензии конидий и фрагментов мицелия гриба Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. и механического повреждения поверхности семядолей, сорт Росинка

ВНИИМК, 2006 г.

Вариант	Титр суспензии, КОЕ/мл	Инкубационный период, сутки	Пораженных семядолей, %	Развитие болезни, %
С повреждением семядолей	5,0∙103	9	13,2	16,8
	1,0∙104	9	27,5	19,2
	1,0∙105	4	30,0	33,0
	2,5∙105	4	30,0	42,0
	5,0∙105	4	42,4	60,0
	1,0∙106	1	70,4	93,4
	1,0∙107	1	100	100
Без повреждения семядолей	5,0∙103	9	5,6	5,8
	1,0∙104	9	10,3	6,4
	1,0∙105	7	11,4	17,6
	2,5∙105	6	15,6	20,0
	5,0∙105	5	25,0	36,0
	1,0∙106	1	43,4	64,0
	1,0∙107	1	61,4	68,0

Выявлено, что титр суспензии гриба A. brassicicola влияет на длительность инкубационного периода альтернариоза. В вариантах с повреждением семядолей проростков горчицы сарептской и без него при увеличении количества спор и фрагментов мицелия патогена в 1 мл суспензии сокращается время проявления первых признаков болезни на семядолях. Минимальный инкубационный период составил всего 1 день при инокулировании их титром 1,0∙10⁶ и 1,0∙10⁷ КОЕ/мл. Количество пораженных семядолей проростков составило: при механическом повреждении поверхности листовой пластинки 70,4 и 100 % соответственно, без повреждения – 43,4 и 61,4 % соответственно.

Развитие болезни при повышении титра суспензии увеличивается, достигая наибольшего значения при инокулировании титром 1,0∙107 КОЕ/мл, в обоих вариантах – 100 и 68,0 % соответственно.

Следовательно, титр суспензии гриба A. brassicicola 1,0∙10⁷ КОЕ/мл является оптимальным для проведения первичной оценки селекционного материала горчицы сарептской на устойчивость к альтернариозу.

Следующим этапом исследований было определение всего температурного диапазона, при котором возможно заражение проростков горчицы возбудителем альтернариоза, и соответствующего ему периода увлажнения (рис. 2).

Для этого в лабораторных условиях проростки инокулировали суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с концентрацией 1,0∙10⁷ КОЕ/мл.

Рисунок 2 – Влияние длительности периода увлажнения и температуры воздуха на инфицирование проростков горчицы сарептской грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts., ВНИИМК, 2006 г.

В опыте рассматривалось три показателя: 5, 50 и 100 % пораженных проростков горчицы сарептской – для того, чтобы определить, при каких условиях начинается процесс инфицирования, отметить массовое проявление признаков альтернариоза и полное поражение проростков.

Установлено, что инфицирование проростков горчицы сарептской грибом A. brassicicola происходит в интервале температур 8,0-28,0 ^оС с удлинением влажного периода до 48 ч. При данных температурах количество пораженных проростков составило 5 %. Наиболее благоприятной можно считать температуру 20 ^оС, при которой первые признаки заражения проявляются уже после 5-часового периода увлажнения. Чем больше температура воздуха отклоняется от оптимальной в ту или иную сторону, тем больший период увлажнения требуется для инфицирования и проявления первых признаков альтернариоза на проростках.

В более узком температурном диапазоне – 12-24 оС – количество пораженных проростков составило 50 % после 50-часового периода увлажнения, при температурах 20 и 24 оС – 100 % через 24 и 36 ч соответственно.

При температуре 28 оС наибольшее количество пораженных проростков, не превышающее 5 %, отмечено при 18-часовом периоде увлажнения. При большей экспозиции увеличения количества пораженных проростков отмечено не было, что, видимо, связано с угнетением процессов жизнедеятельности патогена при длительном воздействии высоких температур.

На основании вышеизложенных данных нами разработана методика искусственного заражения проростков горчицы сарептской в лабораторных условиях без повреждения поверхности семядольных листьев: визуально здоровые семена высевают в стерильный песок в пластиковые ящики и выращивают при температуре 20-22 ^оС. Через 7 дней после посева на все семядольные листья наносят капли суспензии конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл. В течение суток создают влажную камеру, обильно поливая проростки водой и накрывая ящики пленкой. Через сутки у восприимчивых растений проявляется пожелтение семядолей, часто с некротическими поражениями, по которым и оценивают их устойчивость, используя модифицированную нами шкалу P. A. Delwiche [4]:

0 – отсутствие пожелтения семядольных листьев;

• 1    – пожелтение семядольных листьев ограниченное, диаметр 0,5-1,0 мм;

• 2    – пожелтение семядольных листьев, диаметр 1,5-3,0 мм;

• 3    – темные некротические поражения 1,5-3,0 мм, вокруг которых имеется узкая светлоокрашенная полоса больной ткани;

• 4    – темные некротические поражения более 3,0 мм, листья с серо-зелеными некротизированными краями;

• 5    – семядольные листья усыхают полностью.

По данной шкале: 0 – растение устойчивое, 1-2 балла – растение средне устойчивое, 3-5 баллов – растение восприимчивое.

Суспензию, состоящую из конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola, готовят следующим образом. Гриб предварительно выращивают на агаризованной среде Чапека в течение 14 дней при температуре 20-22 ^оС. Стерильной водой проводят смыв конидий и фрагментов мицелия гриба с поверхности среды в чашках Петри. Суспензию взбалтывают, подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл с помощью камеры Горяева. При необходимости проводят разведение таким образом, чтобы в каждом из маленьких квадратов камеры находилось 22-25 или в каждом большом 36-40 конидий и фрагментов мицелия. Для инокулирования семядолей используют только свежеприготовленную суспензию конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola.

С целью оценки растений горчицы сарептской на устойчивость к болезни в камере искусственного климата или полевых условиях необходимо определить оптимальную фазу вегетации, в которую следует проводить инокулирование. В этом случае критериями поражения болезнью служат инкубационный период при инокулировании в определенной фазе, количество пораженных растений и развитие болезни на них.

Относительно зависимости длительности инкубационного периода альтернариоза горчицы сарепт-ской и развития болезни от фазы развития растений, в которую происходит заражение, имеющиеся сведения носят ограниченный характер [3, 6].

Для решения этого вопроса в условиях камеры искусственного климата нами проведено единовременное искусственное заражение растений горчицы сарептской в разные фазы вегетации (розетка, стеблевание, цветение, зеленый стручок, желто-зеленый стручок) возбудителем альтернариоза A. brassicicola и в регулируемых условиях изучено влияние заражения растений альтернариозом на длительность инкубационного периода и развитие болезни (рис. 3).

а)

б)

в)                                             г)

Рисунок 3 – Фазы развития растений горчицы сарептской при искусственном инфицировании в камере искусственного климата (ориг.):

а) розетка, б) стеблевание, в) цветение, г) желто-зеленый стручок.

Растения горчицы сарептской изолировали на все время исследований. Влажность воздуха внутри изоляторов поддерживалась на уровне 90-92 % ежедневным опрыскиванием растений водой, а также помещением в изоляторы влажной ваты. Изолированные растения горчицы сарептской всех фаз развития одновременно инокулировали суспензией спор и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл (табл. 2) . Среднесуточная температура воздуха и длительность светового дня в камере искусственного климата составляли 22 ^оС и 16 ч соответственно.

Таблица 2 – Восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при инокулировании грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. в разные фазы развития растений (камера искусственного климата), сорт Росинка

ВНИИМК, 2004-2006 гг.

Фаза вегетации растений в момент инокулирования	Инкубационный период, сут.	Количество пораженных растений, %	Развитие болезни, %
Розетка	0	0	0
Стеблевание	10	64,0	15,7
Цветение	7	100	56,1
Зеленый стручок	4	100	51,2
Желто-зеленый стручок	2	100	64,7

Из данных, представленных в таблице 2, следует, что наименьший инкубационный период альтерна-риоза отмечен в фазе желто-зеленого стручка, – 2-е суток. Количество пораженных растений и развитие болезни в этой фазе было максимальным – 100 и 64,7 % соответственно. При инокулировании растений патогеном в фазе стеблевания потребовалось 10 дней для проявления первых признаков альтернариоза. Количество пораженных растений и развитие болезни составило 64,0 и 15,7 % соответственно.

Следовательно, при оптимальных условиях для развития гриба A. brassicicola растения горчицы са-рептской в условиях камеры искусственного климата наиболее восприимчивы к альтернариозу в фазе желтозеленого стручка.

Перед нами стояла задача проверить восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при искусственном заражении растений в полевых условиях. Растения также изолировали на все время проведения исследований. Под один изолятор помещали два рядом растущих растения. Внешний вид изолятора из спан-бонда (материал для парников) представлен на рисунке 4.

Инокулирование растений горчицы сарептской суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola проводили в вечерние часы в безветренную погоду. Учеты проводили ежедневно в течение 14 дней.

Среднесуточная температура воздуха за время проведения опыта составляла 14,6-24,6 оС. Заражение растений альтернариозом отмечено в диапазоне температур от 17,5 до 24,6 оС.

Как в условиях камеры искусственного климата, так и в полевых условиях при искусственном заражении растения горчицы сарептской обладают разной степенью восприимчивости к альтернариозу в зависимости от фазы развития в момент инокуляции возбудителем болезни.

Рисунок 4 – Изолятор на растениях горчицы сарептской (ориг.)

Восприимчивость растений горчицы сарептской к болезни повышается по мере их роста и развития (табл. 3).

Таблица 3 – Восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при инокулировании грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. в разные фазы развития растений (полевые условия), сорт Росинка

ВНИИМК, 2004-2006 гг.

Фаза вегетации растений в момент инокулирования	Инкубационный период, сут.	Количество пораженныхо растений, %	Развитие болезни, %
Розетка	0	0	0
Стеблевание	11	54,0	13,2
Цветение	8	100	54,1
Зеленый стручок	4	100	47,9
Желто-зеленый стручок	2	100	63,4

При инокулировании растений суспензией спор патогена в фазе розетки признаков болезни не отмечено. С начала стеблевания до желто-зеленого стручка происходит увеличение количества пораженных растений и развития болезни, достигая в фазе желто-зеленого стручка 100 и 63,4 % соответственно. Инкубационный период альтернариоза при заражении растений в этой фазе составил 2-е суток. При иноку-лировании растений горчицы сарептской в фазе зеленого стручка альтернариоз получает развитие на 4,0-7,0 % ниже, чем в фазе цветения. Одним из объяснений этого факта может являться физиологическая устойчивость тканей зеленых стручков горчицы.

Следовательно, при старении ткани растения горчицы сарептской (фаза желто-зеленого стручка) более подвержены проникновению возбудителя альтернариоза внутрь клеток.

На основании вышеизложенных данных нами адаптирован метод искусственного заражения растений возбудителями болезней Б. В. Квасникова [1] для инфицирования горчицы сарептской возбудителем альтернариоза с целью оценки селекционного материала на устойчивость к болезни в камере искусственного климата и полевых условиях. Суть его заключается в следующем: инокулируют 20 растений без внешних признаков поражения болезнями суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл в наиболее уязвимой для них фазе развития – желто-зеленый стручок – с помощью пульверизатора. Расход суспензии – 5 мл/раст. Растения поливают, накрывают изоляторами из спанбонда, помещают внутрь мокрую вату. После первых суток дополнительно опрыскивают растения стерильной водой и смачивают вату. Через 2 суток проводят учет поражения растений возбудителем болезни.

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009

Выводы: 1. При первичной оценке селекционного материала горчицы сарептской на устойчивость к альтернариозу проростки следует инокулировать суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassi-cicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл в условиях влажной камеры без повреждения поверхности семядольных листьев в течение суток при температуре 20–22 ^оС.

• 2.    С целью оценки сортообразцов горчицы сарептской на устойчивость к болезни в камере искусственного климата и полевых условиях растения инокулируют суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0∙10⁷ КОЕ/мл в фазе желто-зеленого стручка.