Использование биологических методов при микроклональном размножении культурного винограда

Введение. Сегодня развитие виноградарства является одним из приоритетных направлений в системе разработки планов и программ стратегического планирования промышленности в РФ [1]. В России закладка новых виноградников осуществляется как отечественным, так и импортным посадочным материалом. Собственная питомниководческая база позволяет обеспечить лишь 20– 25 % потребности в привитых саженцах [2]. Импортные сорта зачастую не приспособлены к почвенно-климатическим условиям виноградарских регионов Российской Федерации и нередко бывают плохого качества [3]. Увеличение производства винограда, повышение устойчивости ампелоценозов может быть достигнуто за счет внедрения в производство высокоценных сортов винограда отечественной селекции с повышенной устойчивостью к болезням, филлоксере, морозу, что позволит существенно снизить пестицидную нагрузку на окружающую среду [4]. Интенсификация виноградарства определяет необходимость разработки новых эффективных технологий, способов и методов включения их в систему производства оздоровленного посадочного материала [5]. Низкий коэффициент размножения является главным сдерживающим фактором процесса внедрения нового сорта в производство при использовании традиционных способов, из-за которого за один сезон невозможно получение большого количества посадочного материала винограда [6]. Одним из доступных способов повышения коэффициента размножения является использование современных достижений биотехнологии, а именно микроклональное размножение винограда [7, 8]. Также применение биологически активных соединений при достратификационном замачивании семян винограда может быть использовано для повышения всхожести гибридных семян и как следствие ускорения процесса выведения новых сортов винограда [9, 10]. При использовании технологии микроклонального размножения в промышленных масштабах существует ряд трудностей [11–13]. Для каждого растительного объекта, вводимого в культуру in vitro, необходим индивидуальный подход и тщательный подбор состава питательной среды, исполь- зуемой при микроклональном размножении с учетом крайне непредсказуемой сортоспецифичности и его генотипических особенностей [14–18]. Таким образом, изучение способов оптимизации питательной среды для увеличения коэффициента размножения in vitro и, соответственно, повышения эффективности процесса получения свободного от вирусных заболеваний, качественного посадочного материала винограда является обоснованно перспективным и актуальным направлением исследований современной науки.

Цель и задачи исследования: изучение биологических способов повышения выхода посадочного материала винограда при размножении in vitro путем модифицирования питательных сред и способа повышения выхода сеянцев для ускорения селекционного процесса.

Объекты и методика исследования. В опыте по подбору оптимизированной питательной среды для введения сортообразцов винограда в культуру in vitro: сорта винограда (Красностоп АЗОС, Августин, Алиготе, Кишмиш 342, Рислинг, Гранатовый, Шасла × Берландиери 41Б, Берландиери × Рипариа СО4, Руджиери 140, Молдова, Бархатный, Каберне Совиньон, Аттика, Берландиери × Рипариа Кобер 5ББ, АЗОС – 4), минеральный, гормональный состав сред, а также стимуляторы и регуляторы роста растений (6-БАП и ГК3).

Подбор оптимизированной питательной среды для введения сортообразцов винограда в культуру in vitro по 90 шт. эксплантов проводили согласно следующей схеме опыта:

• 1.    Контроль – модифицированная питательная среда Мурасиге и Скуга (М1).

• 2.    Среда М1 по прописи Н.И. Медведевой (М2).

• 3.    Модифицированная питательная среда по патенту А.Н. Реброва.

Опыт микроклонального размножения проводился по общепринятым методикам в лабораторных условиях ФГБНУ СКФНЦСВВ. В качестве стерилизующего средства были использованы дезинфицирующие таблетки ОКА-ТАБ, содержащие 50 % активного хлора (обработка 0,5 %-м раствором в течение 5 мин с 3-кратной промывкой дистиллированной водой). В целях оздоровления сортообразцов винограда использовали экспланты размером 0,3–0,5 мм. На первом этапе при вводе апикальных меристем растений винограда в культуру in vitro использовали следующие классические среды: Мурасиге и Скуга, М1 по прописи Н.И. Медведевой, а также модифицированная по патенту А.Н. Реброва (табл. 1).

Таблица 1

Компонент питательной среды	Концентрация, мг/л
	M1 (контроль)	M2	Патент А.Н. Реброва
1	2	3	4
1. Макроэлементы:
KNO 3	1900,0	1900,0	1100,0
NH 4 NO 3	1650,0	1650,0	400,0
MgSO 4 7H 2 O	370,0	370,0	330,0
Ca(NO 3 ) 4H 2 O	–	–	450,0
CaCl 2	331,0	440,0	65,0
KH 2 PO 4	170,0	170,0	–
2. Хелат железа:
FeSO 4 7H 2 O	27,8	27,8	28,9
Na 2 ЭДТА	37,3	37,3	38,65
3. Микроэлементы:
MnSO 4 5H 2 O	24,1	22,3	22,3
H 3 BO 3	6,2	6,2	6,2
ZnSO 4 7H 2 O	8,6	8,6	8,6
Na 2 MoO 4 2H 2 O	0,25	0,25	0,25
CuSO 4 5H 2 O	0,025	0,025	0,025
KJ	0,83	0,83	0,60
CoCl 2 6H 2 O	0,025	0,025	0,025
4. Витамины:
мезо-инозит	75,0	100,0	75,0
пиридоксин HCl	5,0	5,8	0,35

Окончание табл. 1

1	2	3	4
пароаминобензойная кислота	5,0	–	–
тиамин HCl	5,0	–	0,35
никотиновая кислота	5,0	5,3	–
5. Аминокислоты:
глутамин	50,0	–
глицин	10,0	–
6. Фитогормоны:
аденин сернокислый	80,0	–	–
6-бензиламинопуриновая кислота	0,5	2,0	0,35
7. Другие вещества:
NaH 2 PO 4 H 2 O	170,0	–	175,0
Na 2 HPO 4	–	170,0	–
сахароза (г/л)	30,0	30,0	25,0
агар-агар (г/л)	7,0	6,0	6,0
цефотаксима натриевая соль	–	10,0	–

Состав используемых питательных сред

Результаты исследования и их обсуждение. В ходе экспериментального опыта было установлено, что на первом этапе культивирования эксплантов сортообразцов винограда наилучшей питательной средой для большинства сортов является модифицированная среда по патенту А.Н. Реброва (рис. 1). Так, приживаемость экс- плантов сортов Красностоп АЗОС, Берландиери × Рипариа СО4, Руджиери 140 составила 100 %. Но необходимо отметить сортоспецифичность, так, для сорта Аттика лучший состав среды в данных исследованиях был Мурасиге и Скуга (контроль), а для сорта Каберне Совиньон – М1 по Н.И. Медведевой (вариант 2).

□Приживаемость эксплантов в среде MS. %

□Приживаемость эксплантов в среде Ml. %

□ Приживаемость эксплантов в преобразованной среде по патенту Реброва А.Н.. %

Рис. 1. Приживаемость эксплантов сортообразцов винограда в разных питательных средах, %

Развитие в кластер-побеги от 2 до 4 мм наблюдалось после высадки прижившихся меристем через 30 дней. В дальнейшем кластер-побеги пересаживали на ту же питательную среду по модифицированной прописи патента А.Н. Реброва. На этапе введения эксплантов их приживаемость на модифицированной питательной среде по патенту А.Н. Реброва была достаточно высокая: 80,0 % – у сорта Аттика; 68,9 – у сорта Шасла × Берландиери 41Б; 66,6 % – у сорта Руд-жиери 140 (рис. 2).

Исключение составил сорт Каберне Совиньон, у которого процент инфицированных побегов было максимально высоким – 100 %. Рост регенерантов растений до 6 см наблюдался через 20–35 дней. Далее было проведено их микроклональное размножение и высадка в биологические пробирки размером 30 × 100 мм. Пробирки переносили в культуральную комнату с условиями, оптимальными для роста развития микрочеренков сорто-образцов винограда. В настоящее время микрочеренки находятся в стадии культивирования.

■ Приживаемость. %

Рис. 2. Приживаемость кластер-побегов сортообразцов винограда на модифицированной питательной среде по патенту А.Н. Реброва

Выводы. Установлено, что для большинства сортообразцов винограда наилучшей питательной средой для приживаемости эксплантов являлась модифицированная по патенту А.Н. Реброва с содержанием гибберелловой кислоты в концентрации 0,1 мг/л.

Таким образом, использование гибберелловой кислоты в виноградарстве является эффективным за счет высокой отзывчивости эксплантов винограда на ее применение, что позволяет существенно повысить эффективность микроклонального способа размножения винограда.