Использование конъюгатов наночастиц золота для иммунотерапии опухолей животных

Противоопухолевые вакцины предназначены для инициации и усиления иммунного ответа, направленного против злокачественных клеток [2]. Их разработка основана на способности опухолевых клеток экспрессировать либо гиперэкспрессировать антигены, распознаваемые иммунной системой и потенциально индуцирующие Т-клеточный ответ. В со- став противораковой вакцинной платформы, как правило, входят три ключевых компонента: антигенный материал, представленный опухолеассоциированными антигенами или неоантигенами белковой, углеводной либо гликопротеиновой природы; носитель, обеспечивающий транспорт антигена в лимфоидные органы; и адъювант, способствующий повышению иммуногенности антигена [3]. Вместе с тем эффективность трансляции противоопухолевых вакцин из экспериментальных исследований в клиническую практику определяется возможностью преодоления ряда существенных ограничений. Одной из основных проблем является недостаточное поступление и накопление вакцинных компонентов в лимфатических узлах после введения. Кроме того, антиген может неэффективно захватываться, процессироваться и презентироваться дендритными клетками, что ограничивает активацию антиген-специфического CD8+ Т-клеточного ответа необходимой интенсивности [4].

Одним из перспективных путей преодоления указанных ограничений является использование наноразмерных материалов в составе противоопухолевых вакцин [5]. Согласно опубликованным данным, органические и неорганические наночастицы способны повы- шать стабильность антигенов, усиливать их доставку и накопление в лимфатических узлах, а также оптимизировать захват, внутриклеточный процессинг и кросс-презентацию антигенов антигенпрезентирующими клетками. Помимо этого, наноматериалы могут активировать сигнальный каскад NF-kB, влиять на продукцию цитокинов и регулировать экспрессию микроРНК, вовлечённых в контроль пролиферации и миграции опухолевых клеток [6].

Среди наноматериалов, рассматриваемых для создания противоопухолевых вакцин, особое внимание привлекают наночастицы золота (НЧЗ) [7]. В составе вакцинных систем они могут выполнять двойную функцию, выступая как платформой для доставки антигена, так и компонентом с адъювантными свойствами [8]. НЧЗ обладают относительной химической инертностью и биосовместимостью, а также характеризуются технологической доступностью синтеза. Дополнительным преимуществом является возможность контролируемой модификации их поверхности различными биомолекулами, включая антигены белковой, пептидной, углеводной и иной природы. Уникальные плазмонно-резонансные свойства НЧЗ создают возможности для трекинга биораспределения вакцин, полученных на их основе, а также для создания мультимодальных нанокомпозитов, совмещающих в себе эффективную доставку Аг, фототермическую активность и возможность визуализации. НЧЗ активно используют для разработки антибактериальных, противовирусных и антипаразитар-ных вакцин [9].

Работа R. P. Brinãs et al. (2012) стала одним из первых сообщений о возможности индукции иммунного ответа у лабораторных животных на опухолевые Аг, конъюгированные непосредственно с НЧЗ без использования дополнительных адъювантов [10]. В качестве нанопрепарата применяли НЧЗ, конъюгированные с эндо- и экзоантигенами: гликопептидным Аг муцином MUC-4, модифицированным Аг Томсена–Фриденрейха, а также пептидом из комплементного белка C3d. Отмечали статистически достоверное повышение уровня Ат классов IgG и IgM в крови через 12 недель после вакцинации. Позже была показана возможность получения Ат, специфичных к опухолевому Tn-антигену, гликопептиду MUC-1, фибронектину, конъюгированными с НЧЗ.

Экспериментальная апробация пептидной противоопухолевой вакцины на основе НЧЗ проводилась в работе [11]. Мышам подкожно вводили конъюгаты НЧЗ и эпитопа овальбумина. Через 7 дней после последней иммунизации животных заражали меланомой линии B16-OVA. Мыши, которых иммунизировали НЧЗ, покрытыми Аг, демонстрировали 100% выживаемость в течение 50 дней проведения эксперимента. В исследовании [12] впервые была показана принципиальная возможность использования НЧЗ в комплексе с термоста- бильными опухолевыми Аг для противоопухолевой вакцинации. Таким образом, НЧЗ являются перспективными кандидатами для повышения эффективности и безопасности иммунотерапии рака [13, 14, 15].

Цель исследования – использование конъюгатов НЧЗ для иммунотерапии опухолей, в частности, получение конъюгатов НЧЗ с Аг, выделенными из клеток гепатоцитов мыши линии МН22а, и применение полученных конъюгатов для иммунотерапии животных с привитыми опухолями.

Условия, материалы и методы. Клетки мышиной гепатомы линии МН22а были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Культивирование проводили в среде DMEM (БиолоТ, Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (БиолоТ), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 292 мкг/мл L-глутамина (Gibco, Ирландия). Клеточную культуру поддерживали в стерильных флаконах для адгезионных клеток до образования конфлюэнтного монослоя.

Выделение антигенов. Выделение поверхностных клеточных антигенов (антигенного экстракта; antigenic essence) проводили 0,2% раствором трипсина по методу [16] с нашими модификациями. Технология антигенных эссенций дает возможность улучшить эффективность антиопухолевой вакцинации, поскольку эссенция включает в себя все разнообразие нативных клеточных Аг. Культуральные флаконы с монослоем клеток мышиной гепатомы МН22а промывали четырежды сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Для каждого флакона использовали по 10 мл раствора, что соответствовало приблизительно 40 мкл/см2 площади культуральной поверхности. После промывания в каждый флакон добавляли 15 мл среды DMEM, содержащей 4 мМ L-глутамина и 2 мМ фенилметилсульфонилфто-рида. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 °C на качалке при скорости вращения 1 об/ мин. Далее клетки обрабатывали 0,2% раствором трипсина. Полученную клеточную суспензию переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 600 g в течение 15 мин. Полученный препарат осветляли центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Концентрацию белка в лизате определяли методом Брэдфорда. Для фракционирования антигена использовали осаждение сульфатом аммония. На первом этапе к препарату добавляли сульфат аммония до 40% насыщения – 24,2 г на 100 мл раствора – и инкубировали в течение 1 ч при 4 °C при постоянном перемешивании. Затем образец центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 4°C. Отбирали супернатант, после чего в нём повышали концентрацию сульфата аммония до 80% насыщения. Смесь вновь центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 4 °C. Полученный осадок растворяли и диализовали про- тив 0,2 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ), pH 7,2, в течение 48 ч при 4 °C, регулярно заменяя буферный раствор. После завершения диализа препарат замораживали до последующего использования.

Синтез золотых наночастиц. Золотые наночастицы сферической формы синтезировали методом Френса [17], основанным на восстановлении тетрахлороауратной кислоты цитратом натрия. В колбе Эрленмейера, оснащенной обратным водяным холодильником, 240 мл деионизованной воды нагревали до кипения. Затем в реакционную систему вносили 2,5 мл 1% водного раствора HAuCl 4 (Sigma -Aldrich, США). После этого добавляли 7,75 мл 1% раствора цитрата натрия (Fluka, Швейцария) и проводили реакцию при интенсивном перемешивании. Размер и морфологические характеристики полученных золотых наночастиц оценивали с помощью спектрофотометрии, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и динамического рассеяния света (ДРС).

Получение конъюгатов золотых наночастиц с антигеном. Перед получением конъюгата антигена с 15-нм золотыми наночастицами определяли золотое число, под которым понимали минимальную концентрацию Аг, предотвращающую индуцированную NaCl агрегацию золотого золя. Раствор антигена с исходной концентрацией 1 мг/мл подвергали последовательному двукратному разведению в 96-луночном микротитровальном планшете. К 20 мкл каждого разведения добавляли 200 мкл коллоидного раствора НЧЗ (А 520 =1,0) и 20 мкл 1,7 М раствора хлорида натрия. Минимальная концентрация антигена, при которой сохранялась коллоидная устойчивость НЧЗ после солевой нагрузки, составляла 12,5 мкг/мл. Конъюгацию антигена с НЧЗ проводили методом физической адсорбции без использования сшивающих реагентов. Для синтеза конъюгата концентрацию Аг устанавливали на уровне 15 мкг/мл, что на 20% превышало определенное золотое число.

Вакцинация животных и трансплантация опухолевых клеток. Мышей линии BALB/c иммунизировали препаратами на основе конъюгата золотых наночастиц и антигена, полученного из цельноклеточного лизата клеточной линии МН22а. Вакцинацию осуществляли дважды с 10-дневным интервалом. Всего было сформировано пять групп, включавших по шесть животных. Первая группа получала внутрибрюшинные инъекции антигена в ФСБ в дозе 3 мкг/животное в объеме 250 мкл. Животным второй группы внутрибрюшинно вводили конъюгат Аг+НЧЗ, содержащий 3 мкг антигена, в объеме 250 мкл. В третьей группе применяли конъюгат Аг+НЧЗ, эмульгированный с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1; итоговый объем введенной эмульсии составлял 500 мкл и содержал 3 мкг Аг. Мыши четвертой группы получали раствор НЧЗ в объеме 250 мкл, тогда как животным пятой группы вводили 3 мкг Аг, эмульгированного с ПАФ в соотношении 1:1, в общем объеме 500 мкл.

Все манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии с международными и российскими требованиями к этическому обращению с животными. Эксперимент выполняли с соблюдением рекомендаций Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, требований Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, и нормативно-правовых актов Российской Федерации.

Выделение перитонеальных макрофагов и лимфоцитов селезенки. После декапитации животных фиксировали на спине и осуществляли разрез кожи по средней линии передней брюшной стенки. Кожный лоскут отсепаровы-вали без повреждения брюшины. В перитонеальную полость вводили 10–15 мл ФСБ (рН 7,2), используя иглу, соединенную со шприцем. Брюшную стенку осторожно массировали, а спустя 5–7 мин через небольшой разрез брюшины отбирали перитонеальную жидкость пастеровской пипеткой. Клеточную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр, после чего клетки трижды промывали ФСБ центрифугированием при 750 g. Осадок ресуспенди-ровали в 1 мл ФСБ и определяли число клеток на анализаторе HaemaScreenvet (Hospitex Diagnostics, Италия) с учетом общего пула полиморфноядерных клеток. Перитонеальные макрофаги культивировали по стандартному протоколу; их концентрация составляла 0,4^10 9 клеток/мл.

Для получения лимфоцитов выполняли разрез брюшины по белой линии живота, после чего извлекали селезенку. Орган механически измельчали стерильными ножницами. Полученные фрагменты ткани гомогенизировали путем протирания через мелкоячеистое сито в чашке Петри, содержащей стерильный ФСБ. Образовавшуюся клеточную суспензию подвергали центрифугированию в градиенте плотности фиколл-урографина. Слой клеток, сформировавшийся на границе фаз и содержащий лимфоциты, аккуратно отбирали в отдельную пробирку. Выделенную лимфоцитарную фракцию трижды отмывали ФСБ с рН 7,2 центрифугированием при 750 g в течение 10 мин. После завершения отмывки клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ. Количество выделенных лимфоцитов определяли на гематологическом анализаторе HaemaScreenvet.

Исследование дыхательной активности клеток. Метаболическую активность перитонеальных макрофагов и спленоцитов оценивали МТТ-колориметрическим методом, основанным на восстановлении клетками МТТ до нерастворимого формазана [18]. Суспензии клеток опытных и контрольных групп вносили в лунки планшета по 200 мкл и инкубировали в атмосфере CO 2 в течение 72 ч. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли по 20

мкл 0,5%-ного раствора МТТ, после чего планшеты дополнительно инкубировали в течение 3,5 ч. Исходный раствор МТТ готовили на основе ФСБ в концентрации 5 мг/мл; реагент хранили при 4°С в защищенной от света емкости не более 14 суток. После завершения реакции из лунок осторожно удаляли по 165–170 мкл надосадочной жидкости. Для растворения образовавшихся кристаллов фор-мазана в каждую лунку добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида. Содержимое лунок тщательно перемешивали пипетированием или встряхивали планшет на микрошейкере до полного растворения формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 560 нм на микропланшетном спектрофотометре Spark 10M (Tecan, Швейцария). Коэффициент метаболической активности клеток рассчитывали по формуле: К=ODопыт/ODконтроль, где ODопыт – оптическая плотность образца опытной группы, а ODконтроль – оптическая плотность соответствующего контрольного образца.

Результаты и обсуждение. Спектральный максимум поглощения полученного коллоидного золя золота регистрировался при длине волны λmax=518нм. Оптическая плотность препарата, измеренная в кювете с длиной оптического пути 1 см, составляла A518=1,1. По данным ТЭМ синтезированные наночастицы имели преимущественно сферическую форму, а их средний диаметр составил 15,4±1,3 нм нм (рис. 1). Расчётная концентрация наночастиц в коллоидном растворе при значении А520=1 составляла 1,6×1012 частиц/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что для иммунизации могут быть использованы сферические наночастицы золота со средним диаметром около 15 нм. В условиях настоящего исследования данный размер наночастиц был выбран в качестве оптимального для дальнейшего применения в составе иммуногенных композиций [19].

На рисунке 2 представлены результаты оценки метаболической активности перитонеальных макрофагов, выделенных у животных различных экспериментальных групп после вакцинации и последующей трансплантации опухоли. Наиболее выраженное увеличение показателя было зарегистрировано у животных, иммунизированных конъюгатом Аг+НЧЗ. Метаболическая активность макрофагов в данной группе превышала соответствующее значение контрольной группы, получавшей НЧЗ, в 3,24 раза. У животных, вакцинированных композициями Аг+НЧЗ+ПАФ и Аг+ПАФ, показатель был выше контрольного уровня в 2,3 и 2,1 раза соответственно. Введение нативного Аг также сопровождалось повышением метаболической активности перитонеальных макрофагов – в 1,6 раза по сравнению с контролем.

А                  Б

В

Рисунок 1 - Спектр экстинкции (A), ТЭМ-изображение (Б) и распределение по размерам частиц (данные ДРС) (в)

Рисунок 2 – Определение дыхательной активности перитонеальных макрофагов. Изменение концентрации формазана при вакцинации животных опухолевыми Аг по различным схемам

На рисунке 3 приведены результаты оценки метаболической активности спленоцитов, выделенных у животных экспериментальных групп после вакцинации и последующей трансплантации опухоли. Согласно данным МТТ-теста, наиболее выраженное увеличение метаболической активности спленоцитов наблюдалось у животных, иммунизированных конъюгатом антигена с наночастицами золота (Аг+НЧЗ): значение показателя превышало уровень контрольной группы, получавшей НЧЗ, в 2,3 раза. В группах, вакцинированных препаратами Аг+ПАФ и Аг+НЧЗ+ПАФ, активность спленоцитов была выше контрольного значения в 2,0 и 1,3 раза соответственно.

Таким образом, применение исследуемых вакцинных композиций сопровождалось повышением МТТ-восстанавливающей активности клеток селезенки, наиболее выраженным при введении конъюгата Аг+НЧЗ.

Рисунок 3 – Дыхательная активность спленоцитов животных, вакцинированных опухолевыми Аг по различным схемам: изменение концентрации образовавшегося формазана.

Через 7 суток после заключительной иммунизации животным осуществляли трансплантацию клеток неопластической линии МН-22а. Первые клинически определяемые признаки роста опухоли регистрировали на 14-е сутки после введения опухолевых клеток. К 21-м суткам после трансплантации новообразования становились наиболее отчетливо визуализируемыми. Группа животных, которую иммунизировали конъюгатом Аг+НЧЗ (2-я группа), продемонстрировала отсутствие опухолевого роста при трансплантации опухолевых клеток линии МН22а в 83% случаев (опухоль образовалась у одной мыши из шести). В 1-й, и 4-й группах была обнаружена 100% приживаемость опухолевых клеток. В 3-й группы опухоли образовались у 4 мышей, в 5-й - у пяти (табл.). Анализ полученных данных показал, что предварительная иммунизация животных конъюгатом Аг+НЧЗ сопровождалась выраженным ингибированием опухолевого роста после трансплантации клеток неопластической линии. Вакцинация данной композицией препятствовала формированию опухолей либо существенно снижала частоту их развития по сравнению с контрольными животными.

Таблица – Вакцинация животных опухолевыми антигенами по различным схемам

Группа	Иммуноген	Количество зараженных животных	Выявлено опухолей
1	Аг	6	6
2	Аг+НЧЗ	6	1
3	Аг+НЧЗ+ПАФ	6	4
4	НЧЗ	6	6
5	Аг+ПАФ	6	5

Выводы. Несмотря на значительные достижения в лечении рака, современные методы терапии часто не способны полностью элиминировать злокачественные клетки. Этот недостаток обусловливает необходимость поиска альтернативных подходов, таких как противораковые вакцины. Использование естественной способности иммунной системы нацеливаться и убивать раковые клетки имеет большой терапевтический потенциал. Однако разработка противораковых вакцин затруднена рядом проблем, включая низкую стабильность, неадекватную активацию иммунного ответа и иммуносупрессивную микросреду опухоли, которые ограничивают их эффективность. Недавний прогресс в различных обла- стях, таких как клик-химия, нанотехнологии, экзосомная инженерия и дизайн неоантигенов, предлагает инновационные решения этих проблем [20].

Согласно данным литературы, использование НЧЗ в составе вакцинных препаратов может способствовать повышению стабильности связанного Аг, его более эффективной доставке и накоплению в регионарных лимфатических узлах, а также усилению захвата антигенпрезентирующими клетками. Эти свойства наночастиц способны повышать эффективность процессинга Аг и последующего формирования специфического иммунного ответа [21]. Следует учитывать, что выраженность указанных эффектов определяется физикохимическими характеристиками наночастиц, включая их размер, форму, поверхностную модификацию, тип антигенного конъюгата и путь введения препарата [22]. Были синтезированы конъюгаты НЧЗ с Аг, выделенными из клеток гепатоцитов мыши линии МН22а с помощью технологии антигенной эссенции. Полученными конъюгатами иммунизировали лабораторных животных. Препарат вводили мышам внутрибрюшинно двукратно с интервалом в 10 дней. Отмечено выраженное усиление дыхательной активности перитонеальных макрофагов и клеток селезенки при иммунизации полученным конъюгатом. Через 7 суток после заключительной иммунизации животным осуществляли трансплантацию клеток неопластической линии МН-22а. Группа животных, которую иммунизировали конъюгатом Аг+НЧЗ, продемонстрировала отсутствие опухолевого роста при трансплантации опухолевых клеток линии МН22а в 83% случаев. Таким образом, впервые показана принципиальная возможность использования НЧЗ в сочетании с раковыми Аг для противоопухолевой вакцинации. Противоопухолевые вакцины на основе опухолевых Аг могут быть значительно улучшены за счет включения в их состав НЧЗ в качестве адъюванта.