Использование секвенирования следующего поколения (NGS) для диагностики пациентов с миелоидными новообразованиями

Введение. Миелопролиферативные новообразования (МПН) — группа гематологических заболеваний клональной природы, характеризующихся чрезмерной пролиферацией клеток миелоидного происхождения. Генетический профиль МПН зачастую очень гетерогенен и соответствующие ему системы стратификации по степени молекулярного риска постоянно дополняются. По наличию высокоспецифической для ХМЛ характерной транслокации t(9;22) (филадельфийской хромосомы РН) принято выделять Ph+ и РН- МПН. Для большинства случаев РН- МПН (эссенциальная тромбоците-мия — ЭТ, истинная полицитемия — ИП и первичный миелофиброз — ПМФ) характерны драйверные соматические мутации, возникающие в гемопоэтических стволовых клетках и активирующие JAK2-STAT сигнальный путь QAK2, CALR, MPL^ [1, 6, 9]. Помимо драйверных мутаций у многих пациентов с МПН обнаруживаются генетические аберрации в генах, ответственных за метилирование ДНК (ТЕТ2, IDH1, IDH2, DNMT3A), модификацию хроматина (ASXL1, EZH2, КМТ2А, SUZ12), сплайсинг (SRSF2, U2AF1, SF3B1, ZRSR2), передачу сигнала (FLT3, KIT, NF1, CSF3R, LNK, SH2B3, CBL, NBAS, KRAS, PTPN11, В RAF, GN AS, STAT3, STAT SB, PDGFRA, PDGFRB), в генах клеточного цикла (ТР53, WT1, NPMiy в транскрипционных факторах (RUNX1, СЕВРА, SETBP1, BCOR, ETV6, PHF6, GATA2) и в генах комплекса когезии ^STAG2, SMC1A, SMC3, RAD21) [1, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Так, для пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) важно определение мутационного статуса генов ASXL1, СЕВРА, DNMT3A, FLT3, IDH1/2, KIT, КМТ2А, NPM1, RUNX1, ТЕТ2, ТР53 и WT1; для пациентов с миелодиспластическим синдромом (МДС) — ASXL1, DNMT3A, EZH2, RUNX1, SRSF2, ТЕТ2, ТР53 и U2AF1; для пациентов с хроническим миеломоноцитарным лейкозом (ХММЛ) — ASXL1, CBL, EZH2, NRAS/KRAS, RUNX1, SETBP1, SRSF2 и ТЕТ2 [3, 4, 6, 7, 8]. Определение мутационного статуса генов в каждом конкретном случае МПН важно не только при постановке диагноза и прогнозировании течения заболевания, но и при выборе наиболее эффективной таргетной терапии (ингибиторы IDH1, FLT3), выборе маркера мониторинга минимальной остаточной болезни [2]. Поэтому в рекоменда ции ВОЗ, помимо стандартных цитологических (клинический анализ крови и исследование миелограммы) и цитогенетических методов исследования (кариотипирование, fluorescent hybridization in situ FISH), включены методы определения мутационного статуса характерных для той или иной нозологии генов [6]. Наиболее перспективным из них является метод высокопроизводительного секвенирования следующего поколения NGS (next generation sequencing), который позволяет анализировать одновременно целый ряд генов (панели генов), участвующих в патогенезе МПН.

Результаты NGS исследования помогают не только подтвердить клональность в сложных диагностических случаях, у пациентов с нормальным кариотипом, но и стратифицировать пациентов на группы риска [1,3,4]. Также стоит отметить, что чувствительность секвенирования по Сэнгеру ограничена 10 % аллельной нагрузкой (VAF, variant allele frequency) и не всегда позволяет обнаружить мутации [1, 9]. При этом на порядок выше разрешающая чувствительность NGS метода (до 1 % VAF) способствует обнаружению мутаций не только de novo, но и, сопутствующих основным, мутаций с низкой аллельной нагрузкой, характеризующих клональную эволюцию заболевания и влияющих тем самым на прогноз течения заболевания [13]. Таким образом, исследование таргетных панелей генов методом NGS позволяет получить наиболее полную информацию о заболевании, которая способствует не только адекватной диагностике миелоидных новообразований, но и определяет прогностические особенности течения заболевания.

Цель исследования. Оценить возможности использования NGS технологии в диагностике и определении прогноза течения заболевания у пациентов с различными вариантами миелоидных новообразований в рамках рутинной лабораторной практики.

Материалы и методы. Проведено исследование у 21 пациента (9 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 36 до 79 лет (медиана Me = 55 лет). Диагноз миелопролиферативных новообразований, не ассоциированных с филадельфийской хромосомой (Ph- МПН), был установлен у 18 больных (в том числе у 5 — в фазе бласт- ной трансформации), миелодиспластических синдромов (МДС) —у 2, первичный острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) —у 1 пациента. Исследование проводилось с целью установления клональной природы заболевания у 12 больных без драйверных мутаций в генахJAK2, CALR, MPL, у остальных — для выявления дополнительных прогностически значимых генетических аберраций. У всех пациентов секвенирование выполнялось с использованием миелоидной панели из 55 генов со средней глубиной прочтения 200х или 1000х на приборе MiSeq (Illumina). При анализе полученных данных применялся 2 % порог частоты встречаемости аллеля (VAF). Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC и ClinVar.

Результаты и обсуждение. По результатам NGS исследования у 21 пациента было выявлено 144 мутации (таблица 1), из которых

• 76,    в соответствии с базами данных COSMIC и ClinVar, были отмечены как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и исключены из последующего анализа. 68 мутаций носили соматический характер, 26 из которых с доказанной клинической значимостью и 42 мутации — с неясным клиническим значением.

Генетические аберрации выявлены у всех исследуемых пациентов, в среднем определялись 7 мутаций (от 4 до 12 у одного больного). При этом мутации соматической природы выявлены в 95 % случаев (20 / 21) в количестве от 1 до 8 (в среднем 3 мутации на одного пациента). В 71 % исследуемых проб (15 / 21) обнаруживались от 1 до 3 мутаций с известной клинической значимостью. При контрольном секвенировании по Сэнгеру клинически значимых мутаций наблюдалась 100 % конкордант-ность с результатами NGS.

Таблица 1

Результаты NGS исследования у пациентов с миелопролиферативными новообразованиями

Дополнительные соматические мутации были обнаружены у всех больных с драйверной мутацией и у 92 % пациентов с Ph-МПН (11 / 12) — с тройным негативным мутационным статусом, что позволило подтвердить клональность и верифицировать диагноз заболевания. Важно отметить, что у 6 из 8 (75 %) больных с обнаруженными 2-мя и более клинически значимыми мутациями наблюдалась бластная трансформация. В группе пациентов с драйверными мутациями бластной трансформации сопутствовали дополнительные клинически значимые мутации в генах ASXL1 (3 / 6), EZH2 (1 / 6), IDH1 (1 / 6), ответственные за эпигенетическую регуляцию (пациенты 1, 4, 6). В то время как у тринегативных по драйверным мутациям пациентов — клинически значимые мутации в генах KRAS (2 / 6) и PTPN11 (1 / 6), ответственные за передачу сигнала (пациенты 12,14,17) (рисунок 1). Наиболее частыми из мутаций с неопределенной клинической значимостью были мутации в генах NF1(4 /21), SETBP1(3 /21) и GA7712(3 / 21), а при бластных фазах — мутации в генах КЕЦЗ / 6) и CBL (2 / 6).

Пациенты с 2 и более клинически значимыми мутациями в анамнезе ассоциировались с высоким риском развития ОМЛ, и наиболее патогенными для такого сценария являлись комбинации с мутациями гена ASXL1. Особый интерес вызывали мутации с неопределенной на данный момент клинической значимостью и их возможный вклад в патогенез и клональную эволюцию МПН. В частности, в нашем исследовании была обнаружена частая встречаемость у пациентов с бластной трансформацией мутаций в гене NF1. Этот ген кодирует активирующий ГТФазу белок (GAP, GTPase activating protein), который участвует в ингибировании RAS / МАРК пути передачи сигнала в клетку, и является супрессором опухолей. Мутации в данном гене часто ассоциированы с развитием ХММЛ и ЮММЛ, устойчивостью к терапии и снижением общей выживаемости [14, 15]. В нашем исследовании только у одного пациента с мутацией NF1 был диагностирован ХММЛ (пациент 17), а у двух других ПМФ (пациент 1) и ОМЛ (пациент 15), но для всех них был отмечен быстрый переход в фазу бластной трансформации.

■ Му тащ п I неясного кл! и веского значения

■ Клинически значимые мутации

Рисунок 1. Встречаемость мутаций в генах у пациентов с бластной трансформацией в анамнезе.

Это позволило нам предположить прогностическую ценность мутаций в гене NF1 для пациентов с комплексным мутационным статусом.

Заключение. Таким образом, данные, полученные при применении NGS технологии, позволяют подтвердить клональную природу заболевания в сложных диагностических случаях, что может послужить основой для разработки наиболее точных прогностических систем стратификации рисков у больных миелопролиферативными новообразованиями и делает возможным персонализированное лечение.