Использование SNP-маркеров для идентификации локусов PL5 и PL8, контролирующих устойчивость подсолнечника к Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni

Введение. Повсеместно распространенной и крайне опасной болезнью подсолнечника является ложная мучнистая роса, вызываемая оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni. Потери урожая при условиях, благоприятных для развития болезни, могут составлять 50–

70 %. По данным разных авторов, в мире обнаружено в 2006 г. 35 рас, 41 – в 2014 г. и 50 – в 2019 г. [1; 2; 3; 4; 5]. Каждый год публикуются сообщения о возникновении новых рас. При этом ранние, менее вирулентные патотипы, такие как расы 100, 300, 700 и другие, замещаются новыми, более агрессивными [1; 2].

Одним из самых эффективных методов контроля над P. halstedii является введение в растение-хозяина доминантных генов Pl , обеспечивающих устойчивость к болезни. К настоящему времени уже картировано 33 гена Pl , расположенных в пяти группах сцепления LG: 1, 2, 4, 8 и 13 [8].

В настоящее время перспективными для использования в селекции являются кластеры генов Pl 5 и Pl 8 , контролирующие устойчивость к 16 расам P. halstedii . . Они были клонированы с помощью метода ПЦР с вырожденными праймерами, построенными на основе аминокислотной последовательности домена NBS-LRR [6; 7]. Авторы показали, что гены Pl 5 и Pl 8 относятся к non-TIR-NBS-LRR классу R-генов и картированы в тринадцатой группе сцепления на генетической карте SSR. Проведенные в последние годы исследования показали, что между генами Pl 5 и Pl 8 расположены Pl 21 , Pl 31 и Pl 32. На этой же хромосоме картирован ген Pl 22 [8]. Это, вероятно, связано с тем, что в области гена Pl 8 расположены 14 RGCs (Re-sistence Gene Candidate), т.е. «кандидатов» в гены устойчивости, и поэтому многие гены картируют в этом районе.

Целью наших исследований было разработать молекулярные маркеры генов Pl 5 и Pl 8 и изучить возможность их использования для определения наличия этих локусов в линиях-дифференциаторах устойчивости подсолнечника, используемых для идентификации рас P. halstedii .

Материалы и методы. Объектом исследования служили 14 линий-дифференциаторов устойчивости подсолнечника, входящих в международный тест-набор для идентификации рас P. halstedii .

Для выделения ДНК применяли метод, основанный на использовании лизирующего буфера, содержащего гексадеци-лтриметиламмоний бромид (СТАВ), с модификациями [11; 12]. Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли визуально по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1%-ном агарозном геле с добавлением 2 мкл бромистого этидия. Электрофорез препаратов ДНК проводили при напряжении 100 V в течение 30 мин в трис-ацетатном буферном растворе (ТАЕ).

Для ПЦР-анализа применили 13 пар праймеров, разработанных для маркирования локуса Pl 8 (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика праймеров для маркирования локуса Pl 8

Наз ва-ние	Последовательность		Размер ампликона (п.н.)
8R1	F:GATGATTTGGTATTGACGACAGG R:AGAAAGAGATGTGACTAAGCGTAATG G		642
8R2	F: R	CATTGGATCAACCCAAAAGC : ACGAGTCTGGTAAATCATGGG	276
8R3	F: R	CTGCTGCTGCCCTCG : AGAGCAATAAGCAAACAATCGC	668
8R4	F: R	AGTTGCCTGAGAATGTTGGC : CCAACTCGACATATCTTCAAACC	608
8R5	F: R	AGCGTTAGATGCTTCGTTATCG : CCCATATTGACAAAGAGTTGAGG	632
8R6	F: R	AGCGTTAGATGCTTCGTTATCG : CGTCTCTGGTAGATCGTTCACC	624
8R7	F: R	ACGACATCGTACCACCATCC : CCGATACCATACCTGAAACCG	556
5R2	F: R	CTTCTTCTTCTTTCCCTGTAGTCG : ATGTAACCCAACCCAACTCG	601
8S1	F: R	AAATGTTGCAGGGACATATAACC : TCTTCAACTCTAGTCAAGGGTGG	470
8S2	F: R	GAATCTCTCATATCCCCTACATCCC : ATACCATACCATACCTGAAACCGG	379
5S1	F: R	TCATATGCTCTTGTTTACTAGGATGGC : GGCGAAATTGGTTCCCG	171
5S2	F: R	CCATACAAATCGTTGCAGTTCC : GTCTGGTAAATCATGGATCAACTCC	423
5S3	F: R	AGTGGGGGGATCTAAATTTTCC : CGTCTCTGGTAGATCGTTCACC	230

Полимеразную цепную реакцию выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мM сульфата аммония; 1,5– 3,0 мM MgCl 2 ; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по

10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК-полимеразы (НПО «СибЭнзим», Россия). Реакции проводили в термоциклере S1000тм (BioRad, США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 95 °С в течение 5 мин, далее 37 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 95 ºС, в течение 30 сек., отжиг праймера при 63 ºС – 30 сек., элонгация при 72 ºС – 1 мин 24 сек., и заключительная элонгация при 72 ºС в течение 10 мин.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в геле, содержащем 2 % агарозы и SВ-буфер, с использованием камеры для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, Россия) при напряжении 200 В, силе тока 100 мА, в течение 30 мин. Для некоторых праймеров электрофорез дополнительно проводили в 8%-ном акриламидном геле в камере для вертикального электрофореза (Хеликон, Россия). Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция).

Результаты и обсуждение. На начальном этапе работы по поиску ДНК-маркеров для генов устойчивости Pl5 и Pl8 к P. halstedii исследовали молекулярногенетический полиморфизм шести STS (Sequence-Tagged Site) локусов ДНК [6; 7]. В результате ПЦР с этими праймерами не было получено специфичных фрагментов ДНК, характерных для линий XRQ, YVQ, 803-1, PM-17 и DM-2 – носителей кластеров генов Pl5/Pl8 [9]. Нам не удалось разделить линии на устойчивые и восприимчивые так, как это описано в работе Radwan с соавторами [6; 7]. По нашему мнению, это связано с большим размером фланкируемого праймерами участка ДНК и, как следствие, амплификаций фрагментов длиною более 1000 пар нуклеотидов. К тому же сравнение нуклеотидных последовательностей этих ге- нов показало наличие большого количества участков ДНК, совпадающих по нуклеотидному составу. Это также создает проблемы при маркировании данных локусов.

Поэтому на базе известных последовательностей 13 STS-маркеров [6] нами были созданы SNP-праймеры (Single Nucleotide Polymorphism). Работа проводилась на кафедре генетики, биотехнологии и семеноводства МСХА имени К.А. Тимирязева. С целью упрощения проведения исследования и анализа результатов для амплификации были выбраны небольшие участки: от 171 до 668 п.н. Их характеристика и нуклеотидный состав представлены в таблице 1. Температура отжига для этих праймеров подбиралась с минимальными пошаговыми различиями, которые позволили бы их комплексное применение в ПЦР -смеси в дальнейшем.

На начальном этапе разработанные SNP-праймеры апробировали на 14 линиях-дифференциаторах устойчивости подсолнечника из международного тест-на-бора для идентификации рас P. halstedii. Каждая из этих линий содержит один или несколько генов Pl, обеспечивающих их устойчивость к определенным расам патогена. Подробная информация об этих линиях, соответствующих им генах устойчивости и группах сцепления, в которых они картированы на генетической карте SSR-локусов, опубликована ранее [9; 10; 12–21].

Результаты ПЦР с разработанными SNP-маркерами показали, что только с двумя (5R2 и 5S1) не было отжига праймера на матрице, с остальными одиннадцатью были получены продукты амплификации.

По локусу 8R1 при амплификации ДНК линий подсолнечника выявлен фрагмент длиною около 642 п.н. только у линии DM-2 – носителя генов Pl5, Pl11, Pl12 [10]. У остальных линий, содержащих локус Pl5 (803-1, YVQ, РМ-17 и XRQ), рав- но как и у линий с его отсутствием, этой фракции выявлено не было.

С праймером 8R2 получены продукты амплификации разной длины (рис. 1). У линий XRQ и DM-2 получены фракции, отличающиеся от остальных (дорожки 2 и 14). Также у линий YVQ и PM-17 (дорожки 9–10) обнаружены фрагменты одной длины, не выявленные у остальных. Однако для линии 803-1 не получено таких фрагментов (дорожка 13). По нашему мнению, апробацию этого праймера необходимо продолжить на других линиях, являющихся носителями генов Pl 5 и Pl 8.

1 2 3 4 5 6 7 8     9 10 И 12 13 14 15 16 К"М

Рисунок 1 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий-дифференциаторов устойчивости подсолнечника с праймером 8R2. Дорожки: 1 – RHA419;

2 – XRQ; 3, 4 – 83HR4RM; 5, 6 – HIR 34;

7, 8 – PSC8; 9 – YVQ; 10 – PM-17; 11 – HAR-5;

12 – HAR-4; 13 – 803-1; 14 – DM-2;

15 – RHA274; 16 – RHA265, Kˉ – отрицательный контроль, M – маркер молекулярного веса, 2019 г. (ориг.)

С праймером 8R3 отжиг состоялся, однако вместо ожидаемого фрагмента длиною 668 п.н. была выявлена фракция размером около 1100 п.н. Эти фрагменты присутствуют почти у всех линий. Аналогичный результат получен и с праймером 8R4. Получены фрагменты ДНК разных размеров: от 750 до 800 п.н., однако не было выявлено фрагмента специфичного для линий с локусами Pl 5 и Pl 8. С праймером 8R7 также не удалось получить ожидаемый фрагмент размером 556 п.н., а у всех образцов был амплифицирован фрагмент длиною 100 п.н. Точно также и с праймером 8S1 не было получено нужной фракции и не выявлено полиморфизма.

C праймером 8R5 получена фракция размером 632 п.н. только у линий RHA-19 и HA-335, носителей генов Pl arg и Pl 6 соответственно. У остальных линий не выявлено амплифицированных фрагментов.

Рисунок 2 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий-дифференциаторов устойчивости подсолнечника с праймером 8S2. Дорожки: 1 – RHA419, 2 – XRQ, 3 – 83HR4RM, 4 – HIR 34, 5 – PSC8, 6 – YVQ, 7 – Ha335, 8 – HAR-5, 9 – HAR-4, 10 – 803-1, 11 – PM-17, 12 – DM-2, 13 – RHA274, 14 – RHA265, M – маркер молекулярного веса, 2019 г. (ориг.)

На рисунке 2 показано, что при амплификации ДНК с праймером 8S2 у девяти линий получены четкие фракции размером 500 п.н., пока не идентифицированные. У линий YVQ (дорожка 6) (носитель гена Pl 8 ) и RHA265 выявлена фракция длиною 423 п.н. По нашему мнению, маркер 8S2 можно использовать для идентификации данного локуса, однако это требует дополнительных исследований.

Рисунок 3 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий дифференциаторов устойчивости подсолнечника с праймером 8S3. Дорожки: 1 – RHA419, 2 – XRQ, 3 – 83HR4RM, 4 – HIR 34, 5 – PSC8, 6 – YVQ, 7 – Ha335, 8 – HAR-5, 9 – HAR-4, 10 – 803-1, 11 – PM-17, 12 – DM-2, 13 – RHA274, 14 – RHA265,

M – маркер молекулярного веса, 2019 г.

(ориг.)

С праймером 8S3 были получены фракции размером 230 п.н., но полиморфизм удалось выявить только при электрофорезе в 8%-ном акриламидном геле (рис. 3). Так же, как и в случае с праймером 8S2, у линии YVQ (носитель гена Pl 8 ) выявлены фракции, не обнаруженные у других линий. По нашему мнению, SNP-праймеры 8S3 и 8S2 пригодны для идентификации локуса Pl 8 в селекционном материале ВНИИМК.

Заключение. Таким образом, наши исследования показали, что три сконструированных нами SNP-праймера – 8R2, 5S2 и 5S3 можно использовать для маркирования локусов Pl 5 и Pl 8 в линиях подсолнечника. Эти маркеры могут стать звеньями системы ДНК-маркеров для идентификации указанных генов и проведения маркер-вспомогательной селекции на устойчивость подсолнечника к возбудителю ложной мучнистой росы.