Испытание ингибиторов металло-беталактамаз для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом

Введение. В ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» большое внимание уделяется изучению микроорганизмов, вызывающих инфекционные болезни у животных [1-11]. Современные данные подтверждают значительную роль сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов, а также их ассоциаций в развитии инфекционных заболеваний животных [12]. Микробиологическое исследование кожных покровов и глубжележащих тканей животных является важным диагностической инструментом

для идентификации этиологических агентов инфекций, вызывающих различные заболевания у животных и воздействия на них различных лекарственных препаратов [13]. Выбор конкретного препарата, его эффективность дозировка и длительность терапии определяются видом микроорганизмов, тяжестью вызываемых ими инфекций и общим состоянием здоровья животного.

Механизм действия в-лактамных антибиотиков заключается в подавлении активности ферментов, необходимых для построения клеточной стенки микроорганизмов (рис. 1).

Рис. 1. Схема подавления активности металло-β-лактамаз ингибиторами Method for inhibiting the activity of metallo-β-lactamases with inhibitors

Вместе с тем микроорганизмы обладают способностью адаптироваться к применяемым антимикробным средствам, развивая устойчивость (резистентность) к ним, поэтому представляло интерес изучить механизм действия в-лактамных антибиотиков и разработать методы разрушения механизма формирования резистентности у микроорганизмов к в-лактамным антибиотикам, связанные с инактивацией ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки бактерий.

В связи с этим повышение эффективности антибиотиков на фоне растущей антибиотико-резистентности остается одной из ключевых задач современной биотехнологии.

Цель исследования - оценить влияние ингибиторов металло-в-лактамаз (МБЛМ) на сох-

ранение антимикробной активности антибиотиков на микроорганизмы.

Задачи: подбор, синтез и оценка комплексообразующих веществ, способных формировать устойчивые комплексы с цинком — металлом, входящим в активный центр МБЛМ и их совместимость с антибиотиками (рис. 2); определение оптимального соотношения антибиотика и ингибитора металло-в-лактамаз (ИМБЛМ); оценка антимикробной активности комбинаций антибиотика с ингибитором металло-в-лактамаз (ИМБЛМ) на смешанной культуре микроорганизмов бактерий - возбудителях болезней дистального отдела конечностей ( Staphylococcus spp. ) и на тест-культуре гриба ( Candida tropicaiis ),

[L-Zn] 2 - БЛМ

Рис. 2. Схематическое представление комплексов ИМБЛМ с двумя ионами цинка Schematic representation of IMBLM complexes with two zinc ions

Объекты и методы. Сбор и анализ данных проведены согласно Р 4.2.3676-20. «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18.12.2020) в 2025 г. в лаборатории ветеринарной санитарии отделения биотехнологии ФГБНУ «Федерального центра токсикологической, радиационной и био- логической безопасности», а также в лаборатории микотоксинов, отделения токсикологии. Тест-культуры были получены в коллекции микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Выбор компонентов ингибиторов металло-β-лактамаз (ИМБЛМ) был обоснован комплексообразующими свойствами ионов цинка, входящих в активный центр β-лактамаз.

Результаты и их обсуждение. Ранее нами совместно с сотрудниками Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова ФИЦ КазНЦ РАН из опытной комплексообразующей реакционной смеси с различными антибиотиками был выделен и охарактеризован устойчивый тартрат-цинковый комплекс (рис. 3). Определена характерная для этого вещества температура плавления >250 °C, а структура выпавшего кристаллического осадка достоверно подтверждена методом рентгеноструктурного анализа. Наличие в составе комплекса ионов цинка как комплексообразующего центра послужило основанием для использования тартратов в качестве прочных комплексообразующих лигандов.

Рис. 3. Результаты рентгеноструктурного анализа цинк-тартратного комплекса (ионы цинка показаны серым цветом)

Results of X-ray structural analysis of zinc tartrate complex (zinc ions are shown in grey)

Для лечения заболеваний крупного рогатого скота применяется β-лактамный антибиотик IV поколения – цефтиофур гидрохлорид (рис. 4), содержащий β-лактамное кольцо, однако, как и другие препараты этого класса, он обладает характерным недостатком, т.к. до сегодняшнего дня не существует доступных ингибиторов ме-талло-β-лактамаз (ИМБЛ) эффективно противодействующих формированию антимикробной резистентности за счет воздействия на метал-ло-β-лактамазы (МБЛМ) микроорганизмов.

Рис. 4. Химическое строение антибиотика цефтиофура, содержащего в молекуле β-лактамный цикл Chemical structure of the antibiotic ceftiofur, which contains a β-lactam ring in its molecule

Результаты и их обсуждение. Цефтиофура гидрохлорид широко используется для лечения болезней копытец у крупного рогатого скота. В связи с этим для дальнейших исследований были подготовлены экспериментальные образ- цы с различными концентрациями и соотношениями этого антибиотика и ИМБЛМ при воздействии на смешанную культуру микроорганизмов вызывающие болезни копытец у коров. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Антимикробная активность разных соотношений антибиотика и ингибитора металло-β-лактамаз на смешанную культуру микроорганизмов Antimicrobial activity of different ratios of antibiotic and metallo-β-lactamase inhibitor on a mixed microbial culture

Результаты исследований (табл. 1, рис. 5, 6) свидетельствуют, что исследуемые ингибиторы, такие как: тартраты, хелатирующий агент – эти-лендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и бис-фосфониевая кислота с радикально замещенными группами (золедроновая кислота) снижают резистентность к данному антибиотику смешанной культуры микроорганизмов ( Escherichia coli , Clostridium perfrinens , Streptococcus spp., Staphylococcus spp.). Наибольший выраженный

антимикробный эффект был достигнут в опыте с ЭДТА (зона задержки роста – 16 мм, больше на 7 мм по сравнению с контролем 9 мм), меньший – в первом опыте (зона задержки роста – 20 мм при контроле 14 мм) – больше, чем у контрольного значения на 6 мм.

Графическое изображение зон задержки роста смешанной культуры микроорганизмов экспериментальными образцами (АБ + ИМБЛМ) представлены на рисунке 6.

Рис. 5. Определение чувствительности смешанной культуры к ИМБЛМ диско-диффузионным методом

Determination of the sensitivity of a mixed culture to IMBLM using the disk diffusion method

Рис. 6. Графическое изображение зон задержки роста, мм (желтые – контроль) Results of measuring delay zones, mm (yellow – control)

Опытный образец	Состав водных растворов	Зона задержки роста, мм
№1	Цефтиофур 10 (мг/мл), тартрат 10 (мг/мл)	20
(контроль)	Цефтиофур 10 (мг/мл)	14
№2	Цефтиофур 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)	16
(контроль)	Цефтиофур 10 (мг/мл)	9
№3	Цефтиофур 10 (мг/мл), золедроновая кислота 1 (мг/мл)	21
(контроль)	Цефтиофур 10 (мг/мл)	13

В следующей серии опытов проведены исследования препаратов на основе амоксициллина с ИМБЛМ (рис. 7) в отношении Staphylococcus aureus . Известно, что амоксициллин проявляет активность против некоторых штаммов золотистого стафилококка, однако неэффективен в отношении метициллин-резистент-ных штаммов, поскольку последние выработали

устойчивость ко всем β-лактамным антибиотикам, включая амоксициллин. Для повышения эффективности амоксициллина против стафилококков его часто комбинируют с клавулановой кислотой – ингибитором β-лактамаз (в частности, пенициллиназ), который защищает амоксициллин от ферментативного разрушения.

Рис. 7. Молекулярное строение амоксициллина с β-лактамным циклом в своей структуре Chemical structure of the antibiotic amoxicillin, which contains a β-lactam ring in its molecule

Амоксициллин отмечается высокой эффективностью в отношении штаммов Staphylococcus spp ., не продуцирующих пенициллиназу. В случае инфекций, вызванных резистентными штаммами, применяют антибиотики других классов, например цефалоспорины последнего поколения.

В таблице 2 представлены результаты изучения антимикробной активности разных концентраций амоксициллина и его активности с ИМБЛМ.

На рисунке 8 представлено графическое изображение значений зон задержки роста Staphylococcus aureus .

Таблица 2

Антимикробная активность амоксициллина с ИМБЛМ в отношении Staphylococcus aureus Antimicrobial activity of amoxicillin with IMBLM against Staphylococcus aureus

Опытный образец	Состав водных растворов	Зона задержки роста, мм
№ 4	Амоксициллин 10 (мг/мл), тартрат 10 (мг/мл)	9
Контроль	Амоксициллин 10 (мг/мл)	12
№ 5	Амоксициллин 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)	15
Контроль	Амоксициллин 10 (мг/мл)	13
№ 6	Амоксициллин 10 (мг/мл), золедроновая кислота 1 (мг/мл)	13,7
Контроль	Амоксициллин 10 (мг/мл)	13

Опытный образец	Состав водных растворов	Зона задержки роста, мм
№ 7	Бензилпенициллин 20 (мг/мл), ЭДТА 30 (мг/мл)	2
Контроль	Бензилпенициллин 20 (мг/мл)	1
№ 8	Цефтиофур 10 (мг/мл), ЭДТА 10 (мг/мл)	2
Контроль	Цефтиофур 10 (мг/мл)	1

Выраженный антимикробный эффект был достигнут в опыте № 7 бензилпенициллина с ЭДТА (зона задержки роста – 2 мм, больше на 1 мм по сравнению с контролем), аналогичный в опыте № 8 цефтиофура с ЭДТА (зона задержки роста – 2 мм при контроле 1 мм).

Таким образом, все опытные образцы с расчетным содержанием ИМБЛ на основе бензилпенициллина, амоксициллина и цефтиофура проявили антимикробную активность в отношении микроорганизмов ( Escherichia coli, Clostridium perfrinens, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Candida tropicalis ). Наиболее выраженная антимикробная и антирезистентная активность отмечалась при использовании цефтио-фура и амоксициллина при добавлении хелатирующего агента – ЭДТА: в опытах № 2 и 3 антибиотическая активность усиливалась почти вдвое. В случае применения амоксициллина выраженный эффект проявлялся при использовании в качестве ИМБЛМ золедроновой кислоты, однако при использовании тартрата отме-

чается обратный эффект, что, возможно, связано с наличием у него конкурирующей реакции с имеющейся в химической структуре антибиотика открытой, легко доступной фенольной группы. В связи с этим необходимо исключать тартрат из состава потенциальных ИМБЛМ в случае использования амоксициллина (а также любых АБ, имеющих свободную фенольную группу в составе молекулы).

Заключение . Полученные данные позволяют сделать вывод, что хелатирующие агенты с высокой молекулярной массой, в частности подобные ЭДТА, обладают ингибирующим действием на смешанную культуру микроорганизмов, штаммы Staphylococcus aureus и даже чрезвычайно устойчивые к воздействию антибиотиков дрожжевые микроскопические грибы ( Candida tropicalis) . Результаты и выводы позволят разработать новые рецептуры препаратов с использованием ИМБЛМ.

Авторы выражают признательность коллегам за помощь в проведении исследований.