Исследование биохимического состава липопротеинов семян подсолнечника

ГНУ ВНИИ масличных культур

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЛИПОПРОТЕИНОВ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА

Липопротеины – это группа сложных белков, локализованных в протоплазме клетки, в состав которых входят липиды. Связь между белками и липидами осуществляется посредством различных взаимодействий, преимущественно гидрофобных и электростатических [8]. Согласно работам [3, 4, 6, 7], липопротеины подразделяют на свободные – белки протоплазмы, или растворимые в воде, и не- растворимые, или структурные – липопротеины биомембран клеток митохондрий и других органоидов растений. Нековалентные связи в липопротеинах между белками и липидами обусловливают возможность свободного обмена липидов и изменение свойств липопротеинов в живом организме. При взаимодействии липидов с белками определенную роль играют также электростатические си- лы притяжения, при этом двухвалентные положительные ионы могут служить связующим звеном между отрицательно заряженными группами липида и белка. Существенное значение в образовании комплексов липид – белок имеют также силы Ван– дер–Вальса и силы гидрофобного взаимодействия. Так, фосфолипиды взаимодействуют с белком своими фосфатными группами и четвертичными атомами азота (фосфотидилхолины и фосфотидилэ-таноламины); свободные жирные кислоты взаимодействуют карбоксильными группами. Фосфолипиды проявляют сродство к аминокислотам, содержащим –ОН; =NH; –NH2; =S группы [8].

Основная группа белков, содержащихся в семенах подсолнечника, рассматривается как запасная или резервная. Помимо запасных белков в семенах содержатся белки протоплазмы, входящие в состав различных структурных элементов клетки. Считается, что липиды, входящие в состав липопротеинов, являются «фасадом», удаление которого вызывает разрушение всей биологической структуры [13]. В свою очередь, белки ограничивают подвижность «прилипающих» к их поверхности липидов и придают системе конформационную стабильность [5]. Белки протоплазмы гетерогенны по компонентному составу и содержанию аминокислот. В совокупности аминокислоты протоплазмы представляют собой эталон сбалансированного для данного живого организма белка. Поэтому белки протоплазмы обычно являются более ценным пищевым продуктом, хотя содержание их в растениях относительно не велико и несравнимо с содержанием резервного или запасного белка [10, 11]. Запасные белки, в противоположность протоплазменным, состоят из сравнительно небольшого числа компонентов и, как правило, не сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот.

Целью нашего исследования являлось биохимическое изучение липопротеинов семян подсолнечника современных сортов и гибридов селекции ВНИИМК (урожая 2006-2007 гг.). Липопротеины растений, в отличие от хорошо изученных липопротеинов человека и животных, исследованы недостаточно. В связи с этим, изучение состава липопротеинов семян подсолнечника и их влияние на биохимические процессы, под действием которых формируется химический состав и технологическое качество растительного масличного сырья, представляет научный интерес и имеет прикладное значение при промышленном получении растительного масла и белка.

Объекты и методы исследований. В работе были изучены белковые фракции липопротеинов семян подсолнечника гибрида Юпитер (в процессе созревания) методом капиллярного электрофореза на анализаторе «Капель-103Р», оборудованном ультрафиолетовым детектором, с длиной волны лампы 254 нм, кварцевым капилляром длиной 0,5 м до детектора и внутренним диаметром 75*10-6 м. Прибор оборудован регулятором источника высо- кого напряжения положительной полярности 325 кВ и пневматическим вводом пробы. Исследование жирно–кислотного состава липопротеинов в созревающих семенах проводили газожидкостной хроматографией на аппаратно-программном комплексе на базе хроматографа «Кристалл 2000М» с детектором ПИД и полярной капиллярной колонкой серии Zebron Wax 7HM-G007-17 – 30 м* 0,32 мм*0,5мк с программированием температуры от 185 до 220 оС и скоростью газа носителя гелия 15 см/с.

Результаты экспериментов. Исследование белков липопротеинов и запасных белков подсолнечника показало сходство их аминокислотного состава. Основными аминокислотами липопротеинов являются: глютамин, аланин, треонин, глицин, гистидин, лейцин, аргинин, метионин и пролин. По данным Дубцовой [8], в липид-белковых комплексах (ЛБК) пшеницы высокое содержание гидрофобных аминокислот, что, по мнению автора, обусловливает склонность ЛБК пшеницы к образованию белковых агрегатов высокой молекулярной массы (белков клейковины). Кроме того, характерной особенностью всех глиадиновых белков является высокое содержание остатков глютаминовой кислоты и пролина [2]. По полученным нами данным, практически половина (7 из 15) аминокислот исследуемых липопротеинов подсолнечника – гидрофобные (аланин, лейцин, метионин, пролин, валин, фенилаланин и триптофан) – 36 %. Однако наибольшую часть составляют полярные аминокислоты – 47 %, а именно аминокислота глютамин (20,4 %), которая служит источником азота и является строительным блоком белков. Совпадение высокого содержания гидрофобных и полярных аминокислот говорит о некоторой универсальности аминокислотного состава белков растительных липопротеиновых комплексов. Достоверность данного предположения, видимо, могут подтвердить последующие исследования липопротеинов других растительных культур.

Полученные данные (табл. 1-2) свидетельствуют о том, что количество белковых фракций колеблется в пределах от 12 до 17. По данным Степуро [11],

Таблица 1 – Фракции белков липопротеинов на 10-й день после переопыления

Время удерживания, мин. Площадь, mAU*сек Доля фракции от общего количества, % 5,3 0,0172 1,13 5,5 0,0093 0,61 7,2 0,0443 2,91 7,4 0,0029 0,19 7,5 0,0424 2,79 7,9 0,0194 1,28 8,0 0,0020 0,13 8,8 0,0052 0,35 9,0 0,6846 45,07 17,5 0,6831 44,98 19,6 0,0031 0,20 22,9 0,0055 0,36 Итого: 1,5190 100,00 по продолжительности удерживания белков в электрическом поле можно судить об относительных молекулярных массах электрофоретических фракций. Чем меньше время удерживания, тем крупнее белковые молекулы, соответственно чем дольше удерживаются молекулы в электрическом поле, тем они легче и меньше по размерам.

Таблица 2 – Фракции белков липопротеинов на 76-й день после переопыления

Время удерживания, мин	Площадь, mAU*сек	Доля фракции от общего количества, %
5,5	0,0768	1,21
5,7	0,0169	0,27
6,8	0,0032	0,05
7,6	0,0082	0,13
7,7	0,0483	0,76
9,2	0,0231	0,36
10,1	0,7165	11,26
10,5	0,1019	1,60
10,7	0,0767	1,21
10,9	0,0964	1,52
11,7	0,0407	0,63
13,1	0,9917	15,58
13,7	0,0058	0,09
14,8	0,0026	0,04
16,2	1,5690	24,65
18,2	2,5804	40,54
21,7	0,0063	0,10
Итого:	6,3644	100,00

Липопротеины, полученные из семян гибрида Юпитер на 10-й день после переопыления, в основном представлены двумя фракциями, которые выходят на 9 и 17 минутах анализа, и их доля составляет 45,07 и 44,98 %. Количество электрофоретических фракций у липопротеинов, полученных из семян подсолнечника при перестое (76-й день после переопыления), возрастает с 12 до 17, и преобладающими являются 4 фракции (92 % от общей суммы белков). Характер изменений фракционного состава липопротеинов указывает на то, что по мере созревания семян идет формирование липопротеиновых комплексов и изменения молекулярных масс их белковых компонентов.

Кроме того, следует отметить, что характер электрофоретических подвижностей белковых фракций липопротеинов зависит от степени зрелости семян. Так, на 10-й день созревания семян выход электрофоретических фракций белков липопротеинов равномерен с 5-й по 9-ю минуты – высокомолекулярные белки, следующая фракция выходит только на 18-й минуте – низкомолекулярные белки. В то время как у липопротеинов, полученных при перестое семян, происходит равномерный последовательный выход электрофоретических фракций белков – с 5-й по 22-ю минуту, что свидетельствует о разнообразном составе белковых фракций липо-протенов (высоко-, средне- и низкомолекулярные белки), чего нельзя сказать о белках липопротеинов в начале созревания семян.

Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Степуро [11]. Основные запасные белки подсолнечника (глобулины) пред-став-лены пятью фракциями, которые выходят на 8, 9, 10, 11 и 15-й минутах, и их доля составляет 10,70; 14,40; 13,05; 23,16 и 11,01 % соответственно.

По результатам исследований липопротеины семян подсолнечника на 2/3 состоят из белков (6068 %) и на 1/3 из липидов (20-27 %) .

Липидный комплекс исследуемых липопротеинов подсолнечника включает: триацилглицеролы – 41 %, фосфолипиды – 32 %, свободные жирные кислоты – 8 %, стерины – 4 %, диацилглицеролы – 3 %, моноацилглицеролы – 1,5 %, эфиры стеринов – 1,5 % и каротиноиды и неидентифицированные липиды – 9 %. По данным Олифсон и Осадчей [9], состав липидов, выделенных из липопротеинов сорго, представлен преимущественно стеринами (36,8– 54,8 %) и фосфолипидами (16,7–47,5 %). При исследовании липопротеинов гороха Азарова [1] пришла к выводу, что содержание триацилглицеро-лов в составе легко извлекаемых липидов достигает 59,7 %, а в связанных составляет не более 36,3 %, в то же время содержание фосфолипидов и жирных кислот в связанном состоянии почти в 2 раза больше по сравнению со свободными.

Содержание жирных кислот в липопротеинах подсолнечника в разные периоды созревания представлено в таблице 3.

Таблица 3 – Жирно-кислотный состав липопротеинов гибрида Юпитер в процессе созревания

Название жирной кислоты	Содержание жирных кислот, %
	Дни созревания
	10-й	37-й	58-й	76-й
Пальмитиновая	8,8	8,5	7,3	7,6
Стеариновая	2,8	2,9	2,0	2,0
Олеиновая	42,8	44,0	39,3	35,9
Линолевая	41,2	40,2	47,4	51,8
Линоленовая	2,6	2,7	2,2	1,2
Арахиновая	0,3	0,3	0,3	0,2
Эйкозеновая	0,6	0,5	0,5	0,3
Бегеновая	0,5	0,4	0,5	0,5
Эруковая	0,4	0,4	0,5	0,5

Из полученных данных видно, что в липопротеинах семян подсолнечника основными являются олеиновая и линолевая кислоты, причем в процессе созревания семян содержание пальмитиновой, стеариновой, линоленовой и олеиновой кислот уменьшается (с 42,8 до 35,9 %), а содержание линолевой увеличивается (с 41,2 до 51,8 %). Содержа-ниеарахиновой, эйкозеновой, бегеновой и эруковой кислот в течение всего процесса созревания остается на постоянно низком уровне. Аналогичная динамика изменения жирно-кислотного состава при созревании семян характерна для запасных липидов (ТАГ) подсолнечника, составляющих основу промышленных растительных масел [13].

Таким образом, проведенные исследования по- казали преобладание белкового компонента в составе липопротеинов семян подсолнечника, что характерно для липопротеинов крови человека высокой плотности [12], так называемых ЛВП, которые обладают высокой физиологической активностью в живом организме. Липопротеины, полученные из растительного сырья, способны переносить не только триацилглицеролы, фосфолипиды и стери-ны, но и незначительное количество углеводородов и спиртов. Помимо этого, они осуществляют перенос жирорастворимых витаминов и ß-каротина. Липопротеины крови осуществляют транспорт липидов в водорастворимой форме из участков их синтеза и всасывания в места, где происходит их хранение или утилизация, обеспечивают поддержание определенного уровня концентрации липидов в плазме крови, тканях, клеточных мембранах и субклеточных структурах. Липопротеины переносят глицериды, фосфолипиды, стерины, а также незначительное количество углеводородов и ациклических спиртов [12]. Очевидно, растительные липопротеины могут выполнять аналогичные функции.

Изучение аминокислотного состава липопротеинов семян подсолнечника в начале и конце созревания показало, что в составе белков липопротеинов из 10 известных незаменимых аминокислот присутствуют 9. Преобладающими являются: глютамин, треонин и гистидин.

В ходе электрофоретического исследования белковых фракций липопротеинов установлено, что при созревании семян в липопротеинах увеличивается количество преобладающих фракций с 2 до 4. В начале созревания преобладают высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции белков, а в конце фракционный состав белков становится более однородным.

Основу группового состава липидной части липопротеинов составляют триацилглицеролы и фосфолипиды, жирно-кислотный состав которых представлен характерными для семян подсолнечника ненасыщенными кислотами (олеиновой и линолевой).