Исследование биохимической активности штамма Lactobacillus sakei LSK-104

Молочнокислые бактерии играют важную роль при производстве ферментированных продуктов питания, ассортимент которых постоянно расширяется. Очень перспективной является разработка новых технологий производства мясных и рыбных продуктов с применением бактериальных концентратов молочнокислых бактерий. Исследованиям в этой области посвящены работы зарубежных ученых [6, 7].

Одним из перспективных для применения в пищевой промышленности видов молочнокислых бактерий являются бактерии вида Lactobacillus sakei. Свое видовое название Lactobacillus sakei получили в связи с тем, что были обнаружены в составе микрофлоры саке, традиционного алкогольного напитка из риса [4, 6]. В настоящее время Lactobacillus sakei широко применяются в составе защитных и стартовых культур ферментированных колбас [5, 6, 7].

Известно, что бактерии вида Lactobacillus sakei относятся к молочнокислым бактериям. Их важность во многом обусловлена тем, что они активно применяются при производстве продуктов из мяса, в том числе ферментированных колбас, в связи с устойчивостью многих штаммов к поваренной соли и низким температурам [4, 7] . Lactobacillus sakei также обладают и другими полезными свойствами. Например, их применение способно повысить безопасность мясных продуктов в связи с синтезом бактериями молочной кислоты и бактериоцинов – белков, подавляющих жизнедеятельность других бактерий, в том числе патогенных [7].

Lactobacillus sakei обладают гем-зависимой каталазой. Это свойство редко встречается у молочнокислых бактерий. Анализ генома этих бактерий показал их способность поглощать железо и гем. Установлено также, что внесение добавок гемового железа в питательную среду увеличивало выживаемость Lactobacillus sakei во время стационарной фазы. В связи с тем, что красное мясо богато железом, которое является частью гема гемоглобина и миоглобина, это свойство является очень важным при производстве мясных продуктов [7].

В лабораторных условиях штаммы Lactobacillus sakei в основном ферментируют глюкозу, N-ацетил-D-глюкозамин, сахарозу, фруктозу и маннозу. Но эти вещества обычно не содержатся в мясе. Было установлено, что эти бактерии могут также ферментировать рибозу, которая присутствует в сыром мясе, через АТФ-зависимую систему. Также имеются сведения о том, что Lactobacillus sakei могут использовать альтернативные источники углерода, такие как нуклеозиды или N-ацетил-нейраминовую кислоту, которые присутствуют в мясе. Утилизация веществ этим видом бактерий зависит от фазы роста. Например, сначала Lactobacil-lussakei утилизировали глюкозу, фруктозу, карнитин, триптофан и яблочную кислоту, затем трегалозу, лимонную кислоту, лизин [7].

Ранее было установлено, что некоторые бактерии этого вида способны продуцировать бактериоцины, такие как сакацин А и сакацин Р, а также лактоцин S. В связи с этим бактерии данного вида широко применяются как защитные культуры при производстве ферментированных колбас [5].

Известно также, что бактерии этого вида играют важную роль при производстве рыбных продуктов. Например, они входят в состав микрофлоры и участвуют в формировании характеристик традиционного ферментированного рыбного продукта – ракфиска, производимого в Норвегии [5]. Также Lactobacillus sakei были обнаружены в ферментированных продуктах из овощей, таких как кимчи и квашеная капуста [7], заквасках из гречихи, пшеницы и тефа [5].

Цель исследования

Целью исследования является изучение биохимической активности штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-104.

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления».

Объектом изучения является штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-104 . Применяемые для изготовления бактериальных культур штаммы были получены из фонда Национального биоресурсного центра – Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра

«Курчатовский институт» (ГосНИИгенетика). Активизация штамма была проведена биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете (ныне ВСГУТУ) [2].

При проведении эксперимента в качестве основы для культивирования использовали гидролизованное молоко и гидролизованную молочную сыворотку. Бактерии реактивировали на готовой полужидкой среде MRS (ООО «НПЦ «Биокомпас-С»).

Количественный учет молочнокислых микроорганизмов проводили методом предельных разведений на агаризованной среде MRS (ООО «НПЦ «Биокомпас-С»).

Для определения способности бактерий ферментировать лактозу применяли лактозопептонную среду (ООО «Биотехновация»).

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследований проводили анализ свойств молочнокислых бактерий вида Lactobacillussakei . Данные о штамме Lactobacillus sakei LSK-104 были получены из паспорта штамма, выданного ГосНИИгенетика, а также из литературных источников.

Оптимальная температура развития этого штамма составляет 37 ° С. Также известно, что штамм является продуцентом молочной кислоты, бактериоцинов, является антагонистом Esherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium , имеет ароматообразующие свойства [1].

Культурально-морфологические особенности штамма Lactobacillus sakei LSK-104 : короткие одиночные палочки со слегка закругленными концами. В зависимости от условий культивирования могут образовывать короткие цепочки.

На жидкой элективной среде MRS в благоприятных условиях через 24 ч штамм образует сильное помутнение. При посеве на твердые питательные среды, разлитые высоким столбиком, формирует круглые непрозрачные колонии с выраженной зоной стерильности. Поверхность колоний гладкая, блестящая.

Имеются сведения о том, что штамм способен расти на MRS-агаре с содержанием NaCl 2-4%, наблюдается слабый рост на MRS-arape с 6-10% NaCl. Штамм устойчив к 0,8%-ному раствору фенола, 40% желчи. Ферментирует эскулин, галактозу, фруктозу, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, мелибиозу, салицин. Оптимальная температура роста 37°С. Кислотность на 2-е сут - 75°Т, на 7-е сут - 110°Т. Проявляет аминоксидазную активность по отношению к тирамину [1].

Реактивация культуры Lactobacillus sakei LSK-104 проводилась на среде MRS, которая рекомендована для культивирования этого штамма, при температуре 37 ° C в течение 72 ч. Количество жизнеспособных клеток к концу стационарной фазы составило 5^10 9 к.о.е./ мл.

В связи со слабой активностью исследуемого штамма к сбраживанию лактозы исследовали возможность активизации биотехнологическим способом, разработанным в ВСГУТУ.

Способность сбраживать лактозу является важным свойством микроорганизмов. В связи с этим второй этап исследований был посвящен изучению способности штамма Lactobacillus sakei LSK-104 ферментировать лактозу. Сначала бактерии вносили в гидролизованное молоко, которое затем выдерживали при температуре (37±1) °С в течение 46-48 ч. Рост бактерий на гидролизованном молоке отмечен не был. На следующем этапе бактерии вносили в лактозопептонную среду, которую выдерживали в термостате при 37°С в течение 72 ч. После 72 ч термостатирования количество жизнеспособных клеток бактерий составило 1х10⁷ к.о.е./мл, при этом было отмечено незначительное изменение цвета среды.

Учитывая низкую активность в исследуемых питательных средах, использовали метод активизации, разработанный в ВСГУТУ.

Гидролиз творожной сыворотки проводили ферментным препаратом в-галактозидазы в течение 2 ч при температуре (37±1) ° С с дальнейшей инактивацией фермента путем стерилизации при (121±1) ° С с выдержкой 20 мин.

Результаты представлены на рисунке 1.

Время, ч

Активная кислотность

Рисунок 1 – Динамика роста бактерий Lactobacillus sakei LSK-104 на гидролизованной сыворотке

Из данных на рисунке 1 видно, что гидролизованная сыворотка является хорошей питательной средой для культивирования L. sakei LSK-104 . Плотность популяции через 48 ч составляет 3×10⁹ к.о.е./мл. Экспоненциальная фаза роста приходится на период между 24 и 48 ч культивирования с последующим переходом в стационарную фазу.

Известно, что бактериальные культуры после реактивации нуждаются в нескольких генерациях для полного восстановления метаболизма. В связи с этим была изучена биохимическая активность L. sakei LSK-104 вo II и III генерациях. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Биохимическая активность Lactobacillus sakei LSK-104

Генерации	Продолжительность культивирования, ч	Активная кислотность	Количество жизнеспособных клеток, к.о.е./мл
II	0	6,82±0,03	7*103
	4	6,79±0,01	1*104
	8	6,56±0,03	5*104
	12	6,34±0,02	1*105
	16	5,93±0,04	8*105
	20	5,89±0,01	1*106
	24	5,75±0,05	4*107
	28	5,56±0,02	1*108
	32	5,34±0,02	9*108
	36	5,28±0,01	5*109
III	0	6,82±0,05	6*104
	4	6,79±0,03	1*105
	8	6,12±0,02	1*107
	12	6,02±0,01	1*109
	16	5,87±0,01	4*109

Культуры II генерации обладают более высокой активностью, титр жизнеспособных клеток составляет 5×10⁹ к.о.е./мл через 36 ч. Наибольшая скорость роста и накопление клеток Lactobacillus sakei LSK-104 наблюдается в III генерации. Количество жизнеспособных клеток в гидролизованной сыворотке порядка 10⁹ к.о.е./мл достигается через 12 ч культивирования.

Установлено, что в отличие от известного способа активизации бифидобактерий которые культивируют на молоке обработанном β-галактазидазой, благоприятной средой для Lactobacillus sakei LSK-104 является гидролизованная сыворотка.

Активизированная культура обладает высокой биохимической активностью, поэтому может быть использована в качестве инокулята для производства бактериального концентрата.

На следующем этапе были уточнены оптимальные условия для наращивания биомассы Lactobacillus sakei LSK-104 на питательной среде, состоящей из осветленной творожной сыворотки с добавлением ростовых факторов.

Оптимальную дозу инокулята определяли по кинетике роста бактерий, отражающей эффективность накопления биомассы и жизнеспособных клеток бактерий.

1%       3%

Рисунок 2 – Подбор условий культивирования Lactobacillus sakei LSK-104

При повышении дозы инокулята от 1 до 5 % отмечается увеличение скорости роста. При увеличении дозы внесения до 10% на начальном этапе происходит увеличение скорости роста, в дальнейшем прирост биомассы замедляется. Возможно, это объясняется механизмами саморегуляции при первоначально высокой плотности популяции. Продолжительность культивирования составляет 20-22 ч при температуре (37±1) ° С.

Характеристика полученного бакконцентрата представлена в таблице 2.

Таблица 2

Показатели качества бактериального концентрата Lactobacillus sakei LSK-104

Наименование показателя	Значение показателя
Консистенция и внешний вид	Однородная, жидкая, допускается отделение сыворотки
Цвет	От белого до светло-желтого с белыми вкраплениями
Предельные значения рН	(5,6-6,82)
Количество бактерий, к.о.е./cм3, не менее Lactobacillus sakei	1010
Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП (колиформы) S. aureus Патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы) Дрожжи и плесени, к.о.е./ см3, не более в сумме	10 100 100 5
Токсичные элементы, не более мкг/кг: Свинец Мышьяк Кадмий Ртуть	0,1 0,05 0,03 0,005

Высокая биохимическая активность - один из главных критериев пригодности бактериальных культур для применения в пищевой промышленности. Разработанный концентрат содержит высокое количество живых клеток (10¹⁰ к.о.е./мл) Lactobacillus sakei LSK-104 и может быть рекомендован для ферментации пищевых субстратов различного состава.

Заключение

Способность к сбраживанию различных углеводов для молочнокислых бактерий широко варьируется внутри таксономической группы и индивидуальна для каждого штамма.

На основании проведенных исследований разработан бактериальный концентрат, обладающий высокой биохимической активностью.

Установлено, что гидролизованная сыворотка в сравнении с гидролизованным молоком является более благоприятной средой для активизации Lactobacillus sakei LSK-104 .

Исследования проведены на средства гранта «Михаил Ломоносов» Германской службы академических обменов (DAAD) и Министерства науки и высшего образования РФ (4.13476.2019/13.2).

The study was funded by the joint scholarship program “Michail Lomonosov” of German Academic Exchange Service (DAAD) and Ministry of Science and Higher Education of Russian Federation (4.13476.2019/13.2).