Исследование биотехнологического потенциала бифидобактерий и пребиотических свойств овсяного толокна

Согласно распоряжению Правительства РФ «Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года» необходимо обеспечить 80 % рынка специализированными продуктами детского питания отечественного производства [15]. Однако на данный момент российский рынок специализированных продуктов детского питания представлен в основном импортной продукцией и не покрывает потребности населения [17].

По распоряжению Правительства РФ № 1364-р от 29.06.2016 «Об утверждении Стратегии повышения качества пищевой продукции в Российской Федерации до 2030 года» необходимо разрабатывать технологии глубокой переработки сельскохозяйственного сырья для получения новых видов специализированной, функциональной и обогащенной пищевой продукции [16].

Поэтому конкурентоспособные инновации и выпуск продукции для сегмента детского питания являются актуальными, особенно в условиях импортозамещения.

Исследования видового состава бифидофлоры у здоровых грудных детей показали наличие В. bifidum, В. longum, В. breve, В. Infantis [2, 4]. Кишечная микрофлора формируется и изменяется с взрослением ребенка и сама поддерживает свой баланс. Однако ряд неблагоприятных факторов (применение лекарственных средств, экологический прессинг, инфекционные заболевания и др.), искусственное вскармливание, введение раннего прикорма сопровождаются уменьшением в кишечнике физиологичной для ребенка микрофлоры и появлением редких штаммов бифидобактерий – В. adolescentis, В. catenulatum, B. dentiumи B. angulatum [2, 8, 11]. Дисбаланс кишечной микрофлоры приводит к функциональным нарушениям органов пищеварения (включая воспалительные заболевания кишечника, аллергию, ожирение, диабет, нарушение обмена веществ и др.) у детей и распространяется на последующие этапы жизни человека, переходя в хронические заболевания [9, 10].

Очевидно, что в пробиотических продуктах для детей качественный состав бифидо-флоры должен соответствовать содержанию этих микроорганизмов в кишечнике здоровых детей. Все известные кисломолочные продукты для детей содержат в основном В. longum и В. bifidum , практически отсутствуют продукты с использованием Bifidobacterium infantis.

Ключевая пробиотическая роль Bifidobacterium infantis состоит в его разнообразной геномной емкости и способности переваривать и утилизировать сложные углеводы [12], расщеплять компоненты пищи, тем самым помогая еще не сформировавшемуся процессу пищеварения детей. Они синтезируют необходимые витамины В1, B6, B9, К и участвуют в выработке определенных гормонов. Польза B. infantis для детей состоит в том, что эти колонии бактерий подавляют рост патогенной и условно-патогенной микрофлоры, ускоряя созревание иммунного отклика, приводят в равновесие иммунную систему, улучшают барьерные функции кишечника и увеличивают выработку органических кислот, губительно действующих на болезнетворные микроорганизмы [13, 14, 17].

Овсяное толокно – уникальный продукт, пищевая ценность которого на порядок выше обычной овсяной муки или хлопьев, так как в нем сохраняются практически все полезные фракции зерна. При производстве толокна осуществляется глубокая гидротермическая обработка овсяного ядра, в результате чего образуется почти полностью клейстеризованный крахмал и увеличивается содержание водорастворимых веществ – декстринов и сахаров (в необработанном овсяном ядре - 7–8 %, после гидротермической обработки - до 15 %), что повышает их усвояемость организмом ребенка [1, 3].

Толокно служит источником пищевых волокон (17,8 %), причем преимущественно водорастворимых β-глюканов, также содержит биофлавоноиды, оказывающие антиоксидантный эффект. Лецитин, содержащийся в толокне, особенно важен для нормального роста и развития детского организма. Его дефицит приводит к нарушению не только умственного, но и физического развития. Он является «строительным материалом» клеточных мембран, нервных тканей человека и основой построения миелиновых клеток нервов, белого вещества головного мозга и защищает его оболочки; лецитин участвует в образовании эритроцитов и гемоглобина, способствует усвоению витаминов А, D, Е и К, обладает гепатопротекторными свойствами, защищая печень [1, 3].

Таким образом, сочетание пробиотиков и пребиотиков растительного происхождения может быть использовано при проектировании сбалансированного питания для детей. Существенным резервом в производстве специализированных молочных продуктов является разработка и внедрение биотехнологий функциональных продуктов на основе инновационных пробиотических бактерий Bifidobacterium infantis и натурального растительного сырья, позволяющих создавать новые виды продуктов детского питания.

Целью работы является изучение биотехнологического потенциала Bifidobacterium infantis и пребиотических свойств овсяного толокна.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований служил штамм Bifidobacterium longum subsp. Infantis DSM 20088, выделенный из кишечника ребенка и активизированный запатентованным методом [5]. В исследовании использовалось толокно овсяное по ГОСТ 2929-75.

Биотехнологические свойства бифидобактерий определяли по стандартным органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям.

Количество колоний клеток бифидобактерий определяли на кукурузно-лактозной среде по МУК 4.2.999.00.

Колонизационный потенциал бифидобактерий определяли по устойчивости бактерий:

• –    к NaCl и фенолу - посевом в молоко с различной концентрацией соли и фенола исследуемой культуры и по образованию сгустка;

• –    к желудочному соку - путем инкубирования бактерий с последующим посевом на питательную среду и определения подсчета выживших бактериальных клеток;

• –    к кишечному соку - посевом в молоко с различной концентрацией кишечного сока исследуемой культуры и по времени образования сгустка.

Количество экзополисахаридов измеряли колориметрическим фенол-кислотным методом [6].

Результаты и их обсуждение

Одним из специфических требований, предъявляемым к пробиотическим бактериальным закваскам, предназначенным для детского питания, является их биотехнологический и колонизационный потенциал. Это означает, что пробиотические бактерии должны обладать высокой скоростью роста и размножения на питательных средах и накапливать достаточную биомассу клеток, иметь отличительные морфологические характеристики для четкой их идентификации, а также колонизироваться в желудочно-кишечном тракте и приспосабливаться к стрессовому воздействию окружающей среды. Важным является изучение иммобилизацион-ной способности бактерий, характеризующей возможность микробных клеток прикрепляться к слизистой оболочке эпителия пищеварительного тракта и оказывать положительное действие на организм хозяина.

Известно, что характерным для бифидобактерий является достаточно высокая чувствительность к воздействию стрессовых факторов. Низкое значение рН желудочного сока, фенол, соли желчных кислот могут оказать губительное действие на бактерии. Пройдя желудок и находясь продолжительное время в тонком кишечнике, бактерии проявляют функциональную активность и пробиотический эффект [7].

В связи с вышеизложенным изучаемый штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis DSM 20088 исследовали по показателям, характеризующим биотехнологические свойства и способность сохранять активность при неблагоприятных условиях культивирования. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Из таблицы 1 видно, что данный штамм бифидобактерий обладает хорошими органолептическим показателями, за исключением в меру жидкой консистенции, которая характерна для всех штаммов бифидобактерий. Эффективная вязкость составила 175сПз, что характерно для бифидобактерий, так как они дают легкотекучие сгустки. Также Bifidobacterium infantis проявил высокие биотехнологические свойства: образование сгустка происходило за 10-12 ч до кислотности 57±2 °Т с образованием достаточного количества клеток - 109 КОЕ/ см3.

Таблица 1 – Характеристика и биотехнологические свойства закваски Bifidobacterium infantis DSM 20088

Показатели
органолептические	микроскопический препарат	титруемая кислотность, ° Т	рН	актив ность-сквашивания, ч	количество клеток бифидобактерий, КОЕ в 1 см3	вязкость, сПз	количество экзополиса-харидов, мкг/см3
сгусток – плотный с глянцевой поверхностью, вкус – чистый, кисломолочный; консистенция – нежная, однородная, в меру жидкая	кокковидные короткие цепочки и диплокок-ковые клетки	57±2	5,4± 0,02	10-12	109	175	7,6

Полученные результаты по количественному содержанию экзополисахаридов свидетельствуют о том, что данный штамм обладает важными производственно-ценными признаками и может выступать в роли фактора, способствующего адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника.

Таблица 2 – Влияние стрессовых факторов на активность Bifidobacterium infantis DSM 20088

Устойчивость штамма бифидобактерий к
хлориду натрия, %			фенолу, %	желудочному соку (рН - 3±0,1)	кишечному соку, % (рН - 6,3)
2	4	6,5	4	КОЕ в 1 см3	20	30	40
+	+	-	+	107	+	+	+

Как видно из таблицы 2, исследования показали хорошую устойчивость культуры Bifidobacterium infantis DSM 20088 к фенолу, желудочному соку (низкому значению рН), кишечному соку (желчи) и соли. Уже через 12 - 16 ч культивирования все исследуемые образцы, кроме образца с концентрацией хлорида натрия - 6,5 %, образовали в молоке сгусток. В результате установили, что данный штамм бифидобактерий хорошо переносит желудочный и кишечный стресс.

Таким образом, проведенные исследования показали возможность применения штамма Bifidobacterium infantis DSM 20088 при производстве кисломолочного пробиотического продукта для детского питания.

Далее изучали влияния овсяного толокна на активность бифидобактерий в процессе ферментации. Для этого в нормализованное молоко с температурой 35 - 40 ° С вносили разные дозы толокна, подвергали тепловой обработке, выдерживали определенное время, охлаждали до температуры 37±1 ° С, вносили закваску бифидобактерий Bifidobacterium infantis DSM 20088 в количестве от 2 до 7 % с интервалом 1 % и ферментировали. В качестве контрольного образца использовали молочную основу.

Экспериментальные исследования проводили с использованием метода математического планирования второго порядка. Матрица проведения эксперимента представлена в таблице 3.

Таблица 3 – Матрица проведения эксперимента

Xu Yu Z1 0 1 59 0 5 64 4 1 62 4 5 68 0 3 60 4 3 66 3 1 62 3 5 65 3 3 63 где Xu - массовая доза толокна, %; Yu - массовая доза закваски бифидобактерий (АН), %.

Процесс контролировали по показателям кислотности (Z 1 ). Полученные результаты обработаны в пакете Statiatica 6.0. и представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Функция отклика изменения титруемой кислотности в зависимости от массовой доли компонентного состава продукта

Данные рисунка 1 свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением вносимых ингредиентов является доза толокна 2-3 %, а закваски - 3-5 %. При этом кислотность достигает значения 61-68 ° Т, которое является наиболее физиологичным и приемлемым для детского организма.

Влияние массовой доли толокна на продолжительность ферментации и накопление клеточной концентрации бифидобактерий представлено на рисунках 2 и 3 соответственно.

Рисунок 2 – Влияние массовой доли толокна на продолжительность ферментации при дозе закваски 3 %

Из рисунков 2 и 3 видно, что в молочно-растительных смесях интенсифируется процесс кислотообразования по сравнению с контрольным образцом. Полученные данные свидетельствуют, что ускоряется процесс образования сгустка и повышается кислотообразующая способность бифидобактерий. Так, титруемая кислотность в образцах с массовой долей толокна от 2 до 4 % составила 61-66 ° Т, активизировался процесс образования сгустка от 7,5 до 6 ч. Тогда как в контрольном образце образование сгустка произошло только по истечении 9 ч до кислотности 59 ° Т. Следует отметить, что при дозе закваски 5 % время сокращается и составляет 5 ч при дозе толокна 3 %.

Сравнительный анализ изменения общего содержания клеточной концентрации бифидобактерий в ферментированных смесях показал, что растительная добавка стимулирует развитие бифидобактерий до 10 9 КОЕ в 1 см 3 через 6 - 7,5 ч при дозе толокна в количестве 2 - 4 %. В контроле это же количество клеток бактерий накапливается только через 9 ч ферментации.

Время ферментации, ч

Контроль 2%  3%  4%

Рисунок 3 – Влияние массовой доли толокна на рост клеток бифидобактерий

Ростостимулирующее влияние толокна на бифидобактерии можно объяснить богатым химическим составом муки, содержащей водорастворимые вещества - декстрины, сахара и пищевые волокна, обладающие бифидогенными свойствами.

Исходя из результатов исследования установили, что целесообразной является доза толокна в количестве 3 %, а закваски - 3 - 5 % в зависимости от необходимых условий, возникающих перед изготовителем.

Микроскопические картины продукта без добавки и с добавлением толокна показаны на рисунке 4.

б

а

Рисунок 4 – Морфология бифидобактерий в зависимости от состава молочной среды: а – без толокна; б – с толокном (1:90 МКМ)

Сравнительный анализ микрокартин показывает, что морфология бифидобактерий изменяется в зависисмости от состава среды. Установили положительное влияние толокна на морфологию клеток бифидобактерий, которые утолщаются и за счет влияния пищевых волокон толокна собираются в агрегаты, а затем образуют обширные микроколонии, что способствует их лучшей адаптации и устойчивости к факторам желудочно-кишечной среды.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перспективности использования бифидобактерий Bifidobacterium infantis DSM 20088 и овсяного толокна для получения кисломолочного биопродукта для детей и расширения ассортимента детского питания.

Выводы

В результате проведенных исследований установлен высокий биотехнологический и колонизационный потенциал штамма бифидобактерий Bifidobacterium infantis DSM 20088. Установлено, что он обладает хорошей адгезивной способностью и устойчив к неблагоприятным условиям желудочно-кишечного тракта. Подобрана оптимальная доза овсяного толокна в количестве 3 % и выявлено, что толокно обладает пребиотическими свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности совместного использования пробиотического штамма Bifidobacterium infantis и пребиотика - овсяного толокна для производства симбиотического продукта для детей.