Исследование и сравнительная оценка функциональной и материальной кумуляции нано- и микродисперсного оксида никеля при пероральном пути поступления

На сегодняшний день увеличивающиеся темпы разработки и коммерциализации продукции, содержащей наноматериалы, а также расширение рынка производства продукции с использованием нанотехнологий требуют особенного внимания к вопросам оценки безопасности наноматериалов для здоровья человека и объектов среды обитания [1, 6, 7]. Маркетинговое исследование мирового рынка в 2014 г. показало, что количество произведенных порошков нанодисперс-ных оксидов металлов составило 400000 т, при этом около 20 % произведенной продукции приходится на наночастицы оксида никеля [8]. На-нодисперсный оксид никеля входит в перечень наноматериалов, которые активно внедряются в сферу электроприборостроения, нанооптики, биодиагностики (в качестве биохимических сенсоров), химической и металлургической отраслей промышленности, а также используются для создания различных покрытий, полимеров, текстиля [1]. В процессе деятельности предприятий данных промышленных отраслей возможно загрязнение водных объектов наночастицами исследуемого вещества, что обусловливает возможность его перорального поступления с питьевой водой в организм человека.

В связи с вышесказанным актуальным является исследование и определение параметров

токсичности нанодисперсного оксида никеля при пероральном поступлении, в том числе его способности к кумуляции в организме. Данные исследования продолжают цикл работ по гигиенической оценке безопасности материалов, содержащих наночастицы, проводимых Федеральным научным центром медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения [3].

Материалы и методы. Для оценки кумулятивного эффекта использовали порошок на-нодисперсного оксида никеля с размером частиц менее 50 нм (Sigma-Aldrich, США) [7]. Для сравнительного анализа – порошок мик-родисперсного оксида никеля с размером частиц 10–50 мкм (Sigma-Aldrich, США) [6]. Тестируемые вещества непосредственно перед экспериментальным исследованием переводили в форму водных суспензий посредством внесения порошков в дистиллированную воду, соответствующую ТУ 6-09-2502-77. После чего для разрушения агрегатов и агломератов частиц в исследуемой суспензии нанодисперсного оксида никеля и для равномерного распределения частиц в объеме проводили ультразвуковую обработку на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopuls Hd 3200 (Bandelin, Германия) при комнатной температуре в течение 2 минут в режиме непрерывной пульсации на 65%-ной мощности. Концентрация исследуемого вещества как в суспензии нанодисперсного оксида никеля, так и в суспензии микродисперсного аналога составила 400 мг/см³.

Исследование кумулятивного эффекта водной суспензии нанодисперсного оксида никеля в сравнении с микродисперсным аналогом выполнено по схеме, предложенной R.K.S. Lim и соавт., и в соответствии с МУ 1.2.2869-11 [2, 5]. Для установления параметров кумулятивного действия исследуемых суспензий проведен развернутый эксперимент на белых крысах-самцах линии Wistar массой 290±10 г. Экспериментальные животные были разделены на 3 группы: опытная группа № 1, группа сравнения № 2, контрольная группа № 3 (по 10 особей в каждой группе). Исследуемые водные суспензии нано- и микродисперсного оксида никеля вводили ежедневно однократно внутрижелу-дочно через зонд животным в группах № 1 и 2 соответственно. Расчет доз для ежедневного введения осуществляли с учетом установленной на предварительном этапе исследований ЛД 50 для нанодисперсного оксида никеля при пероральном введении, составившей более

5000 мг/кг массы тела. Введение водной суспензии нанодисперсного оксида никеля осуществляли по схеме: в первые 4 дня вводили дозу 500 мг/кг веса тела в сутки (1/10 ЛД 50 ), каждые последующие 4 дня дозу увеличивали в 1,5 раза до достижения максимально возможной вводимой дозы при однократном введении. Суммарная введенная доза нанодисперсного оксида никеля и соответственно микродисперсного аналога в течение всего эксперимента составила 16250 мг/кг массы тела. Варьирование доз тестируемого вещества достигалось за счет изменения объема вводимой суспензии (в мл раствора) без разбавления. Водную суспензию микродисперсного оксида никеля вводили в аналогичных дозах. Контрольной группе ежедневно однократно внутрижелудочно через зонд вводили дистиллированную воду, соответствующую ТУ 6-09-2502-77, в объеме, аналогичном вводимым суспензиям. Длительность эксперимента по оценке кумуляции исследуемых веществ составила 16 дней. Функциональную кумуляцию – по гибели животных и наличию морфологических изменений в тканях висцеральных органов, материальную кумуляцию оценивали по величине накопления тестируемых веществ в головном мозге, почках, печени. Оценку связи морфологических изменений в тканях с экспозицией тестируемых веществ выполняли по расчету отношения шансов и его доверительного интервала ( OR , DI ). Критерием наличия связи являлось OR >1 [4].

Контроль концентрации вещества в суспензиях нано- и микроисперсного оксида никеля осуществляли непосредственно перед введением животным. В ходе проведения эксперимента оценивали летальный эффект и динамику массы тела животных. Выведение животных из эксперимента осуществляли на 16-й день щадящим методом эвтаназии при помощи углекислого газа.

Для оценки материальной кумуляции никеля у 50 % животных из каждой группы выполняли отбор головного мозга, почек, печени. Количественное определение содержания никеля в образцах осуществляли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent, США) с октопольной реакционной/столк-новительной ячейкой, в качестве газа-реактанта использовали гелий. Для перевода проб в анализируемый раствор образцы в течение 9 часов подвергали термическому озолению в муфельной печи при температуре 450-500 ° С. Расчет концентрации никеля осуществлялся с учетом массы органа. Оценку изменения концентрации никеля в исследуемых органах экспериментальных животных группы № 1 и № 2 выполняли на основании сравнительного анализа с показателями животных контрольной группы № 3.

Все исследования и процедуры осуществлены в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для эксперименталь- ных и иных целей (Страсбург, 1986), и Этическим комитетом ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения».

Результаты и их обсуждение. Анализ результатов исследования функциональной кумуляции нанодисперсного оксида никеля показал, что на протяжении всего эксперимента гибели животных в опытной группе № 1, группе сравнения № 2 и контрольной группе № 3 не установлено. Анализ динамики массы тела экспериментальных животных в группах № 1 и 2 показал, что достоверного изменения данного показателя относительно контрольной группы не наблюдалось (табл. 1).

При этом выявлены морфологические изменения в ткани желудочно-кишечного тракта животных опытной группы № 1, которые характеризовались гиперплазией лимфоидной ткани с образованием реактивных фолликулов и эозинофилией реактивного инфильтрата в тонкой кишке (рис. 1, а ), а также эозинофилией инфильтрата в толстой кишке на фоне гиперплазии клеток Панета (рис. 2, а ). Установлена связь морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте животных с экспозицией тестируемого вещества ( OR =3,5, DI =2,35–4,78).

При исследовании тканей экспериментальных животных группы № 2, получавших внутрижелудочно через зонд водную суспензию микродисперсного аналога, установлены аналогичные морфологические изменения в ткани тонкой и толстой кишки, выявленные у животных группы № 1 (рис. 1, б , 2, б ), но гиперплазии клеток Пеннета не наблюдалось (см. рис. 2, б ).

Установлена связь морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте животных с экспозицией тестируемого вещества ( OR =1,8, DI =1,25–2,95).

Выявлены морфологические изменения в паренхиматозных органах (селезенке и печени)

Таблица 1

Динамика массы тела экспериментальных животных при исследовании кумулятивного действия нано- и микродисперсного оксида никеля

Группа	Средняя масса тела в группе, г ( M ± m )		Прирост средней массы тела в группе относительно исходного уровня, %	Межгрупповое различие массы тела относительно контроля на 16-й день эксперимента ( p <0,05)
	до начала эксперимента	на 16-й день
№ 1	275,9±14,8	260,5±19,0	–5,6	0,098
№ 2	289,9±18,2	280,1±38,6	–3,4	0,876
№ 3 (контроль)	281,2±19,1	282,5±15,3	+0,2	–

а

а

б

Рис. 1. Подвздошная кишка крысы, окраска гематоксилином и эозином, х200: а – суммарная доза нанодисперсного оксида никеля 16250 мг/кг; б – суммарная доза микродисперсного оксида никеля 16250 мг/кг

б

Рис. 2. Толстая кишка крысы, окраска гематоксилином и эозином, х1000: а – суммарная доза нанодисперсного оксида никеля 16250 мг/кг; б – суммарная доза микродисперсного оксида никеля 16250 мг/кг

животных группы № 1, проявляющиеся в виде гиперплазии лимфоидной ткани селезенки с увеличением объёма белой пульпы до 45 % (рис. 3, а ) и образования реактивных фолликулов и паренхиматозной белковой дистрофией печени, сопровождающейся инфильтрацией с примесью эозинофилов в портальных трактах и просветах синусоид (рис. 4, а ). Установлена связь выявленных морфологических изменений в селезенке и печени с экспозицией нанодисперсного оксида никеля ( OR =4,5, DI =3,25–5,74).

Морфологическое исследование тканей паренхиматозных органов животных группы сравнения № 2 показало менее выраженные по сравнению с группой № 1 изменения в селезенке, характеризующиеся гиперплазией лимфоидной ткани селезёнки с увеличением объёма белой пульпы до 35 % и эозинофилией марги- нальных зон и красной пульпы (рис. 3, б). Морфологических изменений ткани печени в данной группе не установлено (рис. 4, б). Установлена связь морфологических изменений в селезенке с экспозицией микродисперсного оксида никеля (OR=1,5, DI=3,12–2,47).

При исследовании тканей головного мозга, сердца, легких, почек, надпочечников, костного мозга животных в группах № 1 и 2 морфологических отличий относительно контроля не выявлено.

Анализ результатов исследования материальной кумуляции показал, что у животных группы № 1, получавших водную суспензию нанодисперсного оксида никеля, наблюдается повышение концентрации исследуемого вещества относительно контроля в головном мозге, печени и почках в 4,7, 8,1 и 23,6 раза соответ-

а

а

б

Рис. 3. Селезенка крысы, окраска гематоксилином и эозином, х200: а – суммарная доза нанодисперсного оксида никеля 16250 мг/кг; б – суммарная доза микродисперсного оксида никеля 16250 мг/кг

б

Рис. 4. Печень крысы, окраска гематоксилином и эозином, х200: а – суммарная доза нанодисперсного оксида никеля 16250 мг/кг; б – суммарная доза микродисперсного оксида никеля 16250 мг/кг

ственно. У животных группы № 2, получавших водную суспензию микродисперсного оксида никеля в аналогичных дозах, увеличение концентрации относительно контроля зафиксировано только в мозге и печени – в 2,8 и 2,2 раза соответственно. При сравнении содержания никеля в органах животных групп № 1 и 2 достоверно установлено, что у получавших нано-дисперсный оксид никеля концентрация данного вещества в головном мозге, печени и почках выше в 1,7, 3,6 и 33,0 раза соответственно, чем у получавших микродисперсный аналог (табл. 2).

При введении нанодисперсного оксида никеля экспериментальным животным группы № 1, установлено, что исследуемое вещество преимущественно депонируется в почках, чего не наблюдается при получении микродисперс-ного аналога, и в больших концентрациях об- наруживается в мозге и печени. Данный эффект может быть обусловлен большей адгезией наночастиц к поверхности, что усиливает их проникновение через тканевые барьеры (эпителиальный барьер кишки, гематоэнцефалический барьер).

Выводы. Выполненное исследование показало, что водные суспензии нано- и микро-дисперсного оксида никеля при пероральном пути поступления обладают функциональным кумулятивным действием, но при этом различной степенью выраженности. Несмотря на отсутствие гибели экспериментальных животных, при экспозиции нанодисперсного оксида никеля установлены выраженные морфологические изменения в тканях тонкой и толстой кишки, селезенке и печени. При экспозиции микродисперсного аналога зафиксированы менее

Таблица 2

Результаты исследования материальной кумуляции водной суспензии нано- и микродисперсного оксида никеля при внутрижелудочном введении

Группа животных Показатель Концентрация никеля оксида в ткани органа, мг/кг мозг печень почки Контрольная, № 3 Среднее значение (M±m) 0,0225±0,009 0,104±0,01 0,046±0,005 № 2 Среднее значение (M±m) 0,062±0,015 0,233±0,02 0,033±0,008 Межгрупповое различие с контролем (p<0,05) 0,026 0,001 0,026 Кратность различий с контролем выше 2,76 2,24 – ниже – – 1,39 № 1 Среднее значение (M±m) 0,1063±0,019 0,843±0,10 1,09±0,13 Межгрупповое различие с контролем (p<0,05) 0,001 0,001 0,001 Кратность превышения контроля 4,7 8,1 23,6 Межгрупповое различие с группой № 2 (p<0,05) 0,030 0,003 0,001 Кратность превышения значений группы № 2 1,7 3,62 33,03 выраженные изменения в тканях тонкой и толстой кишки, селезенке.

Установлено наличие материальной кумуляции у обоих исследуемых веществ, но увеличение концентрации нанодисперсного оксида никеля в ткани головного мозга, печени и почках выше в 1,7, 3,6 и 33,0 раза соответственно по отношению к аналогичным показателям при введении микродисперсного оксида никеля. При этом наблюдается большая выраженность морфологических изменений тканей тонкой (подвздошной) и толстой кишки в виде гиперплазии лимфоидной ткани с формированием реактивных фолликулов, селезенки в виде гиперплазии лимфоидной ткани с увеличением объёма белой пульпы до 45 % и печени в виде паренхиматозной белковой дистрофии. При морфологическом исследовании тканей органов наблюдается меньшая выраженность изменений в желудочно-кишечном тракте и селезенке, изменений в ткани печени не установлено.

Таким образом, наночастицы оксида никеля характеризуются высоким потенциалом преодоления наружных и внутренних барьеров организма (желудочно-кишечного тракта и гематоэнцефалический барьер) по сравнению с микродис-персным аналогом. При длительном поступлении и накоплении обладают потенциальной способностью вызывать морфофункциональные нарушения тканей желудочно-кишечного тракта, паренхиматозных органов, мозга. Медленный процесс элиминации и отсутствие выраженного токсического действия как нано-, так и микро-дисперсного оксида никеля может быть обусловлено высокой степенью связывания с белками плазмы крови.

Результаты выполненных исследований и сравнительной оценки кумулятивного действия нано- и микродисперсного оксида никеля при внутрижелудочном введении через зонд в суммарной дозе, равной 16250 мг/кг, позволили заключить, что тестируемые вещества обладают функциональной и материальной кумуляцией, но степень выраженности кумулятивного эффекта у нанодисперсного оксида никеля выше по сравнению микродис-персным аналогом. Подтверждением функциональной кумуляции у нанодиперсного оксида никеля является наличие также степени выраженности морфологических изменений в тканях тонкой и толстой кишки, печени, селезенки, у микродисперсного оксида никеля – менее выраженные морфологические изменения тканей тонкой и толстой кишки и селезенки, изменений в ткани печени не установлено. Подтверждением материальной кумуляции нанодиперсного оксида никеля является увеличение его концентрации в головном мозге, печени и почках относительно контроля в 4,7, 8,1 и 23,6 раза соответственно, микродисперсного оксида никеля – увеличение концентрации только в мозге и печени, которая в 1,7 и 3,6 раза соответственно меньше таковой в данных органах при экспозиции нанодисперсного оксида никеля. Для более детальной оценки характера действия нано- и микродисперсного оксида никеля на организм при повторных введениях необходимо проведение экспериментов по изучению негативных эффектов и параметров токсичности исследуемых веществ при хроническом поступлении в организм.