Исследование молекулярно-генетических нарушений у больных CBF-ОМЛ методом секвенирования нового поколения

Введение. Подгруппу острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) с хромосомными перестройками t(8;21) и inv(16)/t(16;16) обозначают как CBF -ОМЛ (от англ. «core binding factor»). CBF – гетеродимерный транскрипционный фактор, состоящий из двух субъединиц ( CBF α и CBF β) и играющий ключевую роль в нормальном гемопоэзе. Субъединица CBF α связывается непосредственно с промотерной последовательностью генов, вовлеченных в гемопоэз, а CBF β усиливает афинность связи в образовавшемся комплексе и препятствует его деградации. Оба гетеродимерных компонента вовлечены в хромосомные транслокации, ассоциированные с лейкозом. Хромосомные аберрации t(8;21) и inv(16)/t(16;16) приводят к сцеплению компонентов CBF с другими генами и таким образом изменяют их свойства [1].

Сбалансированная реципрокная транслокация t(8;21)(q22;q22) – часто выявляемая цитогенетическая перестройка у пациентов с ОМЛ (встречается у 15% взрослых de novo ОМЛ), морфологически ассоциируется с M2 вариантом ОМЛ [2]. Транслокация между 8 и 21 хромосомами затрагивает ген RUNX1 на 21 хромосоме и ген RUNX1 T1 на 8 хромосоме. Образующийся в результате химерный ген RUNX1::RUNX1T1 ингибирует транскрипционную активность нормального RUNX1 , что приводит к нарушению процессов созревания и развития гемопоэтических клеток [3]. Транслокация t(8;21) часто встречается вместе с другими хромосомными перестройками, например, с потерей половой хромосомы, а также примерно в 3-4% случаев ОМЛ обнаруживают вариантную t(8;21) [4]. Характерная клиническая особенность пациентов с t(8;21) связана с благоприятным прогнозом течения заболевания, высоким уровнем полных ремиссий (ПР) и длительной медианой общей выживаемости (ОВ) [5].

Инверсия/транслокация inv(16)/t(16;16) – характерные аберрации для ОМЛ с эозинофилией – приводят к сцеплению генов CBF β на 16q22 и MYH11 на 16p13. Инверсия/транслокация inv(16)/t(16;16) является одиночной перестройкой в 70% случаев ОМЛ, дополнительно могут встречаться трисомии 22, 21 и 8 хромосом и делеция 7q, которые не влияют на благоприятный прогноз течения заболевания. 92% пациентов с inv(16)/t(16;16) выходят в ПР с десятилетней ОВ в 55% [6, 7].

Таким образом, оба компонента транскрипционного фактора CBF (α и β) играют ключевую роль в развитии приблизительно 15% острых миелобластных лейкозов. Выявление характерных для данного типа ОМЛ цитогенетических маркеров принципиально важно для определения тактики ведения пациентов. При включении в программу терапии высоких доз цитарабина-доксорубицина, таргетных препаратов, транс- mutation analysis using NGS.

плантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) и иммунотерапии CBF -ОМЛ имеют относительно хороший прогноз [8]. Также в настоящее время появляются все новые таргетные препараты, которые являются высокоэффективными, поэтому актуальность молекулярно-генетических исследований является бесспорной для назначения персонифицированной терапии и поиска новых маркеров-мишеней таргетной терапии.

Несмотря на то, что CBF -лейкозы в различных классификациях относят к группе с благоприятным прогнозом, у 40% пациентов наблюдается рецидив заболевания [9]. Группа достаточно гетерогенна в отношении длительности ПР, что может быть обусловлено наличием дополнительных факторов риска – пожилой возраст, гиперлейкоцитоз, изменения в кариотипе, и наличие широкого спектра мутаций генов, которые находят у более 90% пациентов с CBF -ОМЛ [10].

Известно, что экспрессия химерных генов RUNX1::RUNX1T1 и CBFB::MYH11 недостаточна для инициации развития лейкоза [11, 12]. По этой причине CBF -ОМЛ считаются классической моделью патогенеза в результате кооперации нескольких событий: нарушения нормальной функции транскрипционных факторов ( CBF -комплекс), влияющих на дифференцировку, и возникновение активирующих мутаций, которые усиливают клеточную пролиферацию. Доказательством существования этой модели является факт наличия дополнительных мутаций в генах KIT , FLT3 и N/KRAS , активирующих внутриклеточные сигнальные пути с участием тирозинкиназ, которые встречаются при обоих подтипах CBF -ОМЛ [13, 14].

Цель исследования. Проанализировать геномную гетерогенность ОМЛ c t(8;21) и inv(16)/t(16;16) с использованием метода высокопроизводительного секвенирования и оценить влияние наиболее часто встречающихся аберраций на прогноз.

Материалы и методы. Проведено обследование больных ОМЛ, наблюдавшихся в гематологических клиниках Санкт-Петербурга в 2015-2022гг. Все пациенты получали высокодозную химиотерапию с высоким уровнем выхода в ПР (96%). Исследуемая когорта составила 46 больных CBF -ОМЛ: 21 пациент с inv(16) (тип A – 85%, тип E – 10%, тип D – 5% больных) и 25 больных с t(8;21). Все больные с de novo ОМЛ, 27 (58,7%) мужчин и 19 (41,3%) женщин, медиана возраста составила 58 лет (18-65). Диагноз ОМЛ у всех больных был установлен на основании исследования общего анализа крови, а также цитохимического, цитологического, иммунофенотипического, цитогенетического и молекулярно-генетического исследований периферической крови и аспиратов костного мозга.

Для проведения анализа мутаций методом высокопроизводительного секвенирования геномную ДНК выделяли из образцов костного мозга или периферической крови с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для приготовления NGS-библиотеки использовали не менее 200 нг геномной ДНК. Секвенирование с использованием панели из 118 генов проводили на секвенаторе нового поколения Miseq (Illumina, США), при этом в качестве частоты аллелей вариантов использовалась частота >3%. Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC и ClinVar.

При проведении статистического анализа для сравнения непараметрических данных применяли таблицы сопряжённости признаков с использованием критерия χ² Пирсона. Анализ выживаемости проводили посредством построения кривых по методу Каплана-Мейера. Чтобы сопоставить показатели выживаемости между разными группами, использовали двусторонний лог ранговый тест. Статистическую значимость различий между группами устанавливали при уровне значимости p <0,05.

Результаты и обсуждение. По результатам морфологического исследования ОМЛ с t(8;21) ассоциировался с M2 вариантом (79%), ОМЛ с inv(16) – с М4 вариантом (84%) ОМЛ (по ФАБ-классификации). При проведении цитогенетического исследования у 74% больных с t(8;21) были обнаружены дополнительные хромосомные перестройки – в основном потеря половой хромосомы (-X/-Y), del(9q), +8, +22, -8. В тоже время у 67% больных с inv(16) не было дополнительных хромосомных аберраций, у остальных находили +22, +8, del(17q), t(3;11). Трисомии 8 и 22 хромосом чаще наблюдались у пациентов с inv(16), в то время как потеря X- или Y-хромосомы чаще встречалась при ОМЛ с t(8;21). Это согласуется с предыдущими исследованиями [15].

При этом мы не обнаружили различий в длительности общей и безрецидивной выживаемости у пациентов CBF -ОМЛ с наличием и без дополнительных хромосомных аберраций. Некоторые исследователи пишут о том, что комплексный кариотип, определяемый наличием более 4-х цитогенетических аномалий, может быть связан с худшим прогнозом в группе CBF -ОМЛ [16]. В нашем исследовании была только 1 такая пациентка. Помимо inv(16) у нее были обнаружены множественные изменения кариотипа (44-45,X,del(X)(q24),del(3)(p12p22),del(5) (q13q33),del(6)(p21.3),-9,inv(16)(p13q13),+1-2mar, с вариациями [5]/44-45,X,del(X)(q24),del(3)(p12p22),del(5) (q13q33),del(6)(p21.3),-9,+1-2mar, с вариациями [12]/46,XX[3]), а также методом NGS была выявлена прогностически неблагоприятная мутация в гене FLT3 . Пациентка скончалась через 9 месяцев после начала терапии. В целом прогностическая значимость дополнительных хромосомных аномалий при CBF -ОМЛ является предметом дискуссий, так как данные разных исследовательских групп противоречивы. Например, недавнее исследование показало, что потеря

Х-хромосомы у пациентов женского пола с t(8;21) ассоциирована с более благоприятным прогнозом, тогда как ни мы, ни несколько других исследователей не обнаружили значительного влияния потери хромосомы X на выживаемость пациенток с t(8;21) [17].

По результатам высокопроизводительного секвенирования обнаружены 105 мутаций в 54 из 118 генов-мишеней. У больных ОМЛ с t(8;21) – 70 мутаций, с inv(16) – 35 мутаций. В 25 генах мутации были найдены повторно (≥2-х раз). В 96% случаев больных с t(8;21) и с inv(16) выявили по крайней мере 1 мутацию. В среднем, у больных ОМЛ с t(8;21) находили значительно больше мутаций, чем у пациентов с ОМЛ с inv(16) – 2,8 против 1,7 мутаций, соответственно (р = 0,03). В среднем у больных CBF -ОМЛ находили 5 мутаций (Рисунок 1). При ОМЛ с t(8;21) были мутированы 45 различных генов, при ОМЛ с inv(16) – 19 генов содержали мутации.

40,0

® 35,0 т А 30,0

Е g 25,0

I

J ²⁰-° О а 8 15,0 ’S £ ¹⁰-0 о и м 5_?о 1 ^ 0,0

■ t(8;21)

Количество мутаций

Рисунок 1. Количество мутаций, обнаруженных с помощью метода высокопроизводительного секвенирования у больных с t(8;21) и inv(16)

Из 54 поврежденных генов мутации в 10 генах были общими в обеих подгруппах CBF -ОМЛ, в то время как пациенты с t(8;21) имели значительно более высокую долю частных мутаций (65% (35) против 17% (9) соответственно; р = 0,016). У 1 больного с inv(16) были сочетано обнаружены мутации в генах KIT (D816V) и FLT3 -TKD. Были найдены точечные мутации и инсер-ции/делеции (в генах KIT , ASXL1 , EZH2 , CBL, KMT2C, MYC , FAT1 , RAD21 , MGA ) – при ОМЛ с t(8;21) 14/46 (30,4%), ОМЛ с inv(16) – 6/46 (13,0%). Мутации в RTK/ RAS сигнальных путях были наиболее распространенными событиями при двух типах CBF -ОМЛ, с наибольшей частотой встречаемости в генах NRAS + KRAS (26%; t(8;21) – 16%; inv(16) – 38%), KIT (24%; t(8;21) – 24%; inv(16) – 24%) и FLT3 (4%; t(8;21) – 0%; inv(16) – 10%) (Рисунок 2).

При более тщательном анализе обнаруженных аберраций были выявлены специфические паттерны мутаций: при ОМЛ c inv(16) чаще мутировал кодон Q61 в гене NRAS (5/8), в то время как при ОМЛ с t(8;21) чаще мутировали кодоны G12/G13 (3/3). ОМЛ с inv(16) чаще ассоциировался с изменениями в FLT3 (TKD) (10% против 0%).

Мы оценили молекулярно-генетический профиль больных ОМЛ с t(8;21). Нередкими событиями были прогностически неблагоприятные мутации в генах эпигенетической регуляции – ASXL1 (16%) и EZH2 (8%), метилирования ДНК – DNMT3A (4%), комплекса когезии – RAD21 (8%) и SMC3 (8%), MGA (16%), вовлеченный в сигнальный путь MYC , SETBP1 (8%), которые отсутствовали при ОМЛ с inv(16). Молекулярно-генетический профиль больных ОМЛ с inv(16) отличался тем, что аберрации генов, вовлеченных в модификацию хроматина, были редкими событиями (в гене ASXL1 – 0%), как и мутации генов, относящихся к комплексу когезии, которые отсутствовали во всех случаях. У одного больного обнаружена мутация в транскрипционном корепрессоре BCORL1 . Мутации генов NRAS + KRAS встречались у значительного числа больных с inv(16) (38%).

Когезин представляет собой мультимерный белковый комплекс, участвующий в сцеплении сестринских хроматид, пострепликативной репарации ДНК и регуляции транскрипции, который состоит из 4 основных субъединиц: SMC1A, SMC3, RAD3, STAG [18]. По последним данным, значительно чаще выявляют мутации генов комплекса когезина и мутации модификаторов хроматина у пациентов с t(8;21), чем у больных с inv(16). В нашем исследовании мутации в генах, кодирующих компоненты когезинового комплекса, присутствовали у 24% пациентов с t(8;21) и ни у одного из пациентов с inv(16), причем все мутации генов комплекса когезии были взаимоисключающими между собой, что согласуется с результатами предыдущих исследований [19]. Известно, что мутации генов комплекса когезии чаще встречаются у пациентов ОМЛ с повреждениями гена RUNX1 [20,21]. Mazumdar C. et al. [22] показали, что мутации генов когезинового комплекса приводят к состоянию повышенной доступности хроматина и более высокому уровню связывания с RUNX1. Эти данные позволяют предположить связь между изменениями в когезине и образованием химерного гена RUNX1::RUNXT1. Также мы выявили, что частота мутаций в генах, связанных с эпигенетической модификацией (TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A), низка при CBF-ОМЛ, что согласуется с данными, полученными Park S. et al. [23] и Duployez N. et al. [10]. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что мутации, вовлеченные в эпигенетическую модификацию, не способствуют лейкемогенезу при CBF-ОМЛ.

Также при изучении патогенеза CBF -ОМЛ методом NGS выявляются следующие закономерности: например, множественные мутации в одном и том же сигнальном пути часто встречаются при CBF -ОМЛ, что указывает на явление клональной интерференции. Наличие клональной интерференции не влияет на длительность ремиссий или наличие минимальной остаточной болезни, но может быть связано с ухудшением бессобытийной выживаемости [24].

Далее оценивали прогноз течения заболевания исследуемой группы больных. При обоих подтипах CBF -ОМЛ часто встречались мутации в генах, активирующих сигнальные пути ( KIT , FLT3 и N/KRAS ), мы проанализировали влияние таких мутаций на БРВ. Оказалось, что наличие активирующих мутаций значительно увеличивает риск возникновения рецидива (p = 0,039) (Рисунок 3).

Рисунок 2. Наиболее частые мутации у пациентов CBF-ОМЛ

Рисунок 3. Прогностическая значимость мутаций, участвующих в активации сигнальных путей

Также исследовали влияние на прогноз наиболее часто-встречающихся при CBF -ОМЛ аберраций – мутаций в каталитическом домене гена KIT . У 5 больных выявили наиболее распространенную мутацию D816V, у трех – N822K. У больных с мутациями в гене KIT была тенденция к ухудшению безрецидивной выживаемости (БРВ) по сравнению с больными без мутации (p = 0,068) (Рисунок 4).

Рисунок 4. Прогностическая значимость мутаций в гене KIT

Так как данные мутации могут существенно влиять на прогноз течения заболевания и ухудшать показатели безрецидивной выживаемости больных и ОВ по данным некоторых исследований [25, 26], рекомендуется включить их в перечень обязательных исследований у больных CBF-ОМЛ, как в дебюте заболевания, так и на различных этапах его развития. На сегодняшний день проведение диагностики мутаций в гене KIT включено в рекомендации национальной группы по исследованию рака (NCCN), где CBF-ОМЛ с мутациями в гене KIT относят к группе промежуточного, а не благоприятного риска [27]. Немецкая группа исследователей сообщила, что добавление дазатиниба к терапии первой линии снизило частоту рецидивов при KIT-мутированных CBF-ОМЛ до уровня, сопоставимого с уровнем рецидивов при ОМЛ без KIT-мутации [28]. Однако часть опубликованных данных подтверждает мнение о том, что мутации KIT связаны с неблагоприятным исходом для пациентов с t(8;21), а не с inv(16). Также есть данные о том, что пациенты с мутациями в гене KIT с CBF-ОМЛ могут иметь сопутствующий системный мастоцитоз [29]. Мы не проводили дополнительное обследование пациентов с целью определить наличие системного мастоцитоза в данном исследовании, хотя по литературным данным CBF-ОМЛ с сопутствующим системным мастоцитозом может иметь более неблагоприятный прогноз, особенно если пациенты являются носителями высокой аллельной нагрузки мутации в гене KIT или мутации KIT D816.

Мутации в генах NRAS и KRAS часто обнаруживают у пациентов с CBF -ОМЛ, причем у больных с inv(16) в 2 раза чаще, чем у больных с t(8;21), в нашем исследовании – у 38% больных с inv(16) [30]. Семейство генов RAS состоит из генов NRAS , KRAS и HRAS и играет важную роль в передаче сигналов о пролиферации и выживании клеток. Мутации в 12, 13, 61 кодонах генов RAS приводят к независимой активации RAS сигнального пути [31]. Наши исследования показали, что мутации генов RAS не влияли на частоту выхода в ПР, БРВ или ОВ у больных с t(8;21) и inv (16) ОМЛ.

Заключение. Мы провели обширный мутационный анализ методом NGS для 46 пациентов с CBF -ОМЛ, возраст которых варьировал от 18 до 65 лет. Как и ожидалось, дополнительные аберрации были обнаружены практически у всех больных (96%) и наиболее часто мутировавшим геном был KIT . Подгруппы ОМЛ с t(8;21) и inv(16) в клинических исследованиях часто объединяют с учетом их высокой выживаемости и вовлеченности в патогенез CBF -транскрипционных факторов. Однако у этих групп имеются свои биологические и клинические особенности [32]. Например, морфологически, по ФАБ-классификации, пациенты с t(8;21) имеют М2 подтип ОМЛ (с созреванием), а пациенты с inv(16) – чаще М4Ео (острый миеломоноцитарный лейкоз с атипичными эозинофилами) ОМЛ. При цитогенетическом анализе у пациентов с t(8;21) ОМЛ дополнительные хромосомные аберрации выявляются значительно чаще, чем при inv(16) ОМЛ. Также существенно различающийся спектр генных мутаций был продемонстрирован при ОМЛ с t(8;21) и inv(16)/t(16;16). Мы отметили, что меньшее количество сигнальных путей было задействовано в случаях t(8;21) по сравнению с inv(16)/t(16;16) (80,0% против 96,3%, p = 0,016), в то время как у пациентов с inv(16)/t(16;16) наблюдалось больше мутаций в KRAS и NRAS по сравнению с пациентами с t(8;21) ОМЛ. Прогностически неблагоприятные мутации в генах ASXL1 встречаются примерно у 35% пациентов с t(8;21) [33]. Показано, что мутации в генах эпигенетической модификации ( ASXL1 и EZH2 ) и комплекса когезии ( RAD21 , SMC3 , MGA ) ассоциированы с плохим прогнозом у пациентов, особенно тех, которые имеют дополнительные мутации в генах тирозинкиназного пути, в связи с чем предполагается синергическая кооперация между этими событиями.

Таким образом, хотя показатели выхода в ремиссию у пациентов с t(8;21) и inv(16) одинаково высоки, эти группы имеют значительные отличия между собой, ассоциированные в первую очередь с особенностями молекулярно-генетического ландшафта пациентов.