Исследование нуклеиновых кислот в гонадах пресноводных рыб Байкальского региона

Сведения о способности нуклеиновых кислот повышать общую сопротивляемость организма появились уже в 80-х гг. XIX в. С каждым годом ДНК все шире используется в биологии и медицине . В настоящее время установлено, что нуклеиновые кислоты — один из важных компонентов интегрального и иммунологического гомеостаза организма [1]. Это объясняет широкий спектр общебиологических эффектов (более 10 различных феноменов) как лекарственных препаратов (нуклеоспермат натрия, деринат, ферровир), так и биологически активных добавок (БАД) к пище (ДНКаС и ДНКаВИТ, «Биостим»), созданных на основе нуклеиновых кислот. Все эти соединения обладают радиозащитным, иммуномодулирующим действием, стимулируют устойчивость организма к различным инфекциям, устраняют малокровие, повышают содержание гемоглобина, понижают возбудимость нервной системы, увеличивают мышечную силу [2]. Существуют несколько групп препаратов на основе нуклеиновых кислот: 1) препараты микробного происхождения - одним из первых получен нуклеи-нат натрия - натриевая соль низкомолекулярной дрожжевой РНК, содержащая 1,5—1,6% белка и 2% ДНК, ридостин – двуспиральная РНК, полученная из лизата дрожжей; 2) препараты животного происхождения - наиболее известным является деринат (натриевая соль низкомолекулярной нативной ДНК, полученной из молок осетровых рыб), ферровир, по-лидан, БАД к пище «Биостим» и др.; 3) синтетические препараты - представляют собой искусственно синтезированные РНК, способные стимулировать первичный и вторичный иммунные ответы [3].

Гонады лососевых, осетровых рыб и кальмаров являются основным источником получения ДНК. Несмотря на большое количество разработок в этой сфере, проблема поиска новых источников сырья остается актуальной. Гидробионты отличаются необычай- ным разнообразием по видовому составу и технологическим свойствам. Каждая группа сырья обладает не только отчетливо выраженными биологическими особенностями, но и биохимической спецификой, которая существенно варьируется в зависимости от многих причин (пола, возраста, периода года и т.д.)[4]. Учитывая положительное воздействие ДНК на организм человека, перспективным является изыскание дезоксирибонуклеиновой кислоты в других видах рыб. В данной работе проведено исследование содержания нуклеиновых кислот в пресноводных и эндемичных видах рыб Байкальского региона.

Материалы и методы

Объектами настоящего исследования послужили молоки 12 пресноводных рыб Байкальского региона, которые были выловлены в осенне-весенний период 2008-2009 гг. Сроки хранения замороженного сырья при температуре -18º не превышали 6 месяцев (ТУ 15-01-960-88). Количественное содержание ДНК в сырье определяли по методу Дише, содержание РНК по методу Мейбаума, в препарате – по разнице поглощения азотистых оснований (при 270 и 290 нм) полученных в результате гидролиза ДНК 0,5%-ной хлорной кислотой при 100-105˚С. Определение химического состава молок проводили по общепринятым методикам [1]. Для получения низкомолекулярной ДНК из мороженых молок 34 стадии зрелости использовали метод, разработанный учеными ТИНРО-центра (Пат. № 915446), который включает две стадии – экстракцию водным раствором NaCl и осаждение этиловым спиртом.

ВЭЖХ анализ проводили на хроматографе Agilent 1100 (США) с ультрафиолетовым детектором переменной частоты, установленным на 260 нм. Хроматографию осуществляли на колонке zorbax eclipse XDB – C8 4,6×150 mm 5-micron. В качестве подвижной фазы использовали 0,2 М фосфатный буфер, pH 8,0. Скорость подачи элюента составляла 1,5 мл/мин при температуре колонки 20°С. В течение первых 5 минут элюция была изо-кратической, затем в течение 10 минут следовал линейный градиент (85% фосфатного буфера и 15% воды бидистиллированной). Затем подвижная фаза вновь устанавливалась на 100% фосфатном буфере в течение 5 минут. По окончании каждого анализа колонку уравновешивали 200 мкл бидистиллированной воды. При анализе биологических образцов использовали метод внешнего стандарта. Стандартом сравнения послужил маркер ДНК pBR 322 /Alu 1 (НПО «СибЭнзим», Россия). Исследуемые препараты были приготовлены в подвижной фазе в концентрации 0,2 мг/мл, объем вводимого раствора 20 мкл. Все реактивы фильтровали через фильтр (5 мкм).

Экспресс-оценку токсичности проводили с использованием инфузорий Tetrahy-mena pyriformis [5]. Острую токсичность и анальгетическую активность изучали в Пермской государственной фармацевтической академии на белых мышах весом 20±1,0 г одного возраста, полученных из питомника одновременно и прошедших карантинный режим вивария, без внешних признаков заболеваний. Исследуемые препараты ДНК вводили животным перорально с помощью зонда в различных дозах. Острую токсичность изучали по методике Г.Н. Першина, анальгетическую активность определяли методом «уксусных корчей» на серии по 5 мышей [6].

Результаты и их обсуждения

Анализ полученных данных по содержанию нуклеиновых кислот (табл. 1) показал, что наибольшее содержание ДНК (более 3,0 %) обнаружено в молоках широколобки, омуля, окуня и тайменя. По данным результатам был определен выбор гонад для выделения низкомолекулярной ДНК. Это основано на прямой зависимости процента выхода препарата ДНК от содержания ДНК в молоках различных видов рыб [7]. Остальные виды молок рыб явились неперспективными (содержание ДНК менее 3%).

Таблица 1

Количественное содержание нуклеиновых кислот в молоках пресноводных рыб Байкальского региона, среднее ±σ

Молоки рыб	Содержание ДНК, %	Содержание РНК, %
Широколобка	6,27± 0,56	1,65± 0,093
Омуль	3,75 ± 0,264	0,67 ± 0,035
Окунь	3,73 ± 0,178	0,85 ±0,041
Таймень	3,68±0,183	-
Елец	2,56± 0,125	0,52± 0,039
Карась	2,45±0,116	-
Язь	2,09 ± 0,102	1,18 ± 0,067
Хариус	1,82±0,092	0,2±0,014
Плотва	1,4±0,085	0,09
Налим	1,25±0.076	0,5±0,035
Ленок	1,18±0,086	0,09±0,003
Лещ	0.96 ±0,058	0.16 ± 0,008

Примечание. «-» - не исследованы

Из общего химического состава гонад (табл. 2) можно видеть, что они являются потенциальными поставщиками ценных белков [4]. Содержание белка выше у пресноводных (морские: кета 8,7%, треска 11,9%), но состав его существенно не отличается от состава белка морских рыб.

Таблица 2

Общий химический состав молок пресноводных видов рыб

Вид рыб	Содержание, в %
	влага	белок	зола	ДНК	РНК	другие
Омуль	75,8±1,5	16,5±0,9	2,7±0,2	3,75±0,264	0,67±0,035	0,58
Окунь	79,3±1,4	13,7±0,81	2,02±0,16	3,73±0,178	0,85±0,041	0,40
Широколобка	77,8±1,7	14,28±0,76	-	6,27± 0,56	1,65±0,093	-
Таймень	68,1±1,2	24,3±0,98	2,5±0,17	2,09±0,16	1,18±0,12	1,83
Хариус	80,3±1,45	14,83±0,89	1,95	1,82±0,092	0,2±0,014	0,9

Общее содержание влаги и золы в молоках пресноводных и морских рыб (кета 78,5%, сельдь 71,5%, 2,6%, треска 80,3%, 1,3%) определено приблизительно. Основные вещества могут колебаться в следующих пределах: вода — от 46,1 до 92,9%, азотистые вещества — от 5,4 до 26,8%, минеральные вещества — от 0,1 до 3%. Химический состав не является постоянным, это существенно зависит не только от вида и физиологического состояния рыбы, но и от ее возраста, пола, места обитания, времени лова и условий окружающей среды.

Выделенная низкомолекулярная ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях. Содержание нуклеиновых кислот в препарате достигает 68 – 75 %, молекулярная масса (М.м.), на примере ДНК омуля - 380 кДа. Установлено, что для получения биологически активного продукта пригодна и низкомолекулярная ДНК (М.м. 200500 кДа) [8].

Для подтверждения полученных препаратов ДНК использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. На рисунке 1 показан профиль ВЭЖХ стандартного ДНК маркера на хроматографе Agilent 1100.

D s «о

Oj6              од              1              15

Время, мин

к

Рис. 1. Хроматограмма стандартного ДНК маркера. На колонку С8 5μ нанесено 20 мкл раствора ДНК маркера pBR 322 /Alu 1 (НПО «СибЭнзим», Россия)

§ 8

s я u 8 о

Время, мин

Рис. 2. Хроматограмма солевого экстракта ДНК молок широколобки. На колонку С8 5μ нанесено 20 мкл исследуемого раствора ДНК

Идентификацию пиков определяемых веществ на ВЭЖХ осуществляли по времени удерживания и спектральным отношениям (260 нм) с соответствующими параметрами хроматограмм стандартного ДНК маркера. На рисунках 2 и 3 показаны профили препаратов ДНК молок пресноводных рыб Байкальского региона.

5 600

g 400.

О Ч

О"

К

200 -

0                   0.6                   0,8                   11,2

Время, мин

Рис. 3. Хроматограмма солевого экстракта ДНК молок омуля. На колонку С8 5μ нанесено 20 мкл исследуемого раствора ДНК

Исследование спектральных характеристик низкомолекулярных ДНК различного происхождения позволяет говорить о практически полном сходстве состава азотистых оснований в нуклеиновых кислотах исследованных объектов. Совпадение пиков при одних и тех же длинах волн (260 нм) свидетельствует о весьма близком количественном соотношении азотистых оснований в ДНК исследованных объектов, а различные величины пиков соответствуют установленной разнице в количественном содержании ДНК в препаратах.

При оценке безвредности препарата ДНК с использованием Tetrahymena pyriformis наблюдали наличие роста инфузорий, отсутствие деформации и угнетения подвижности. В результате чего можно сделать вывод о нетоксичности выделенных ДНК. По приросту инфузорий можно говорить, что при добавлении в среду ДНК происходит оптимизация метаболических процессов Tetrahymena pyriformis, что способствует лучшему усвоению питательных компонентов и ускорению роста. Такое действие обеспечивается содержанием в исследуемых веществах олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот. Преимуществом использования инфузорий является большое сходство их токсико-биологической реакции с аналогичной реакцией высших организмов, высокая интенсивность обмена веществ, быстрая смена поколений (2-4 раза в сутки), что позволяет учитывать и возможное воздействие продукта на генетический аппарат клетки [5].

Опыты по определению острой токсичности проводили на белых мышах (ГФ), исследуемые препараты вводили однократно в возрастающих дозах, вызывающих гибель животных от 0 до 100%. В результате исследований установлено, что в соответствии с классификацией по К.К. Сидорову препараты ДНК относятся к 4 классу токсичности, являются малотоксичными.

Анальгетическую активность изучали методом «уксусных корчей», химическим болевым раздражением мышей [6]. Исследуемые препараты вводили перорально за час до инъекции альгогена. Анальгетический эффект оценивали по уменьшению количества корчей в процентах к контролю. Критерием эффективности при скрининге является снижение болевой реакции не менее чем на 50%. По результатам эксперимента была определена высокая анальгетическая активность у ДНК широколобки и омуля. Увеличение латентного периода от введения альгогена у ДНК широколобки составило 7,2 мин, у омуля 4,0 мин в сравнении с контролем 2,8 мин. Среднее количество корчей после введения уксусной кислоты мышам составило у ДНК широколобки 7 корчей, у омуля 13,6 корчей, напротив контроля - 18,4 корчей.

Таблица 4

Сравнение с анальгетической активностью фармацевтического препарата и ДНК из молок широколобки

Соединение	Доза, мг/кг,	Количество корчей	Уменьшение корчей ,%
Метамизол-натрия	50	12,2±1,57	52,5
ДНК широколобки	50	4,8±0,58	78,37

По результатам данного опыта провели дополнительные исследования анальгетической активности препарата ДНК широколобки в разных дозах (30, 40, 50 мг/кг). При сравнении активности лекарственного препарата (анальгина) с ДНК широколобки в одинаковой дозе выявлена больше анальгетическая активность у последнего.

Выводы

Проведенные исследования показали, что молоки широколобки, омуля, окуня и тайменя по содержанию ДНК превосходят остальных видов пресноводных рыб в 3-4 раза. Общий химический состав молок показал, что содержание белка выше у пресноводных (таймень 24,3%, омуль 16,5%) по сравнению с морскими (кета 8,7%, треска 11,9%)

Идентификацию пиков определяемых препаратов ДНК провели по времени удерживания, они совпали в поле допуска со стандартом. Спектральные характеристики свидетельствуют об одинаковом соотношении азотистых оснований для всех исследованных рыб.

Впервые выделен препарат ДНК из молок пресноводных видов рыб Байкальского региона . Содержание нуклеиновых кислот в препарате достигает 68 – 75 %, М.м. ДНК омуля - 380 кДа., данная молекулярная масса входит в пределы биологической активности (200 -500 кДа).

Экспресс-оценка токсичности с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis показала нетоксичность выделенных ДНК. По определению острой токсичности препараты ДНК относятся к 4 классу токсичности, являются малотоксичными.

В ходе эксперимента была выявлена высокая анальгетическая активность ДНК ши-роколобки и омуля. По данным результатам оформлена заявка на патент.