Исследование острой токсичности нового противоопухолевого препарата "Карплазмин-OVA", предназначенного для CAR-T терапии РЭА-позитивных опухолей

По данным Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Сегодня в целом по России на 100 000 человек приходится более 4 000 заболевших. Число летальных исходов от рака в России ежегодно составляет 200 человек на 100 000 населения [1].

Одним из способов определить характер течения болезни и степень агрессивности опухолевого роста является диагностика по охарактеризованным маркерам раковых клеток (онкомаркерам). В клинических условиях предпочтение отдается онкомаркерам, находящимся в сыворотке крови, как наиболее легко детектируемым [2].

Одним из таких маркеров является раково-эмбриональный антиген (CEA, carcinoembryonic antigen, CEA) - поверхностный белок суперсемейства иммуноглобулинов, который обычно экспрессируется во время эмбрионального развития и присутствует в следовых количествах у взрослых. CEA - гликопротеин с молекулярной массой 180 кДа, экспрессирующийся во всех аденокарциномах желудочно-кишечного тракта, в 50 % случаев рака молочной железы, в 70 % случаев немелкоклеточного рака легкого и в клетках некоторых других видов рака [3]. РЭА экспрессируется в тканях эмбриона в ходе внутриутробного развития, а после рождения его продукция детектируется в клетках желудочных ямок, эпителия толстой кишки и в других отделах желудочно-кишечного тракта, в основном на поверхности микроворсинок. Однако уровень экспрессии РЭА в опухолевых клетках значительно превышает его уровень экспрессии в нормальной ткани (в 35 раз и выше). При некоторых формах рака его концентрация в сыворотке крови увеличивается в сотни раз [4,5].

В настоящее время известно, что иммунная система играет важную роль не только в процессе образования злокачественной опухоли, но и во влиянии на уже сформировавшуюся опухоль [9]. Многие современные иммунологические исследования демонстрируют высокий потенциал Т-клеточной адаптивной терапии рака, которая представляет собой переливание аутологичных или аллогенных Т-клеток пациентам [7]. Тем не менее, в настоящее время остаются открытыми вопросы, касающиеся адаптивного переноса Т-клеток, такие как выбор вида Т-клеток для терапии, выбор целевого опухолевого антигена, повышение эффективности невирусной генетической модификации, из-за чего применение терапии ограничено [8].

Адаптивная Т-клеточная иммунотерапия может включать как варианты переливания пациентам интерлейкин-2 активированных лимфоцитов (так называемые LAK- клетки), так и более сложные варианты – когда лимфоциты модифицируются генетически для повышения их таргетности и противоопухолевой эффективности [9].

В этом случае антигенсвязывающий участок моноклонального антитела против опухолеспецифического антигена (иммуноглобулина, Ig) обычно объединяется с ζ-сигнальной цепью Т-клеточного рецептора (TCR) в качестве распознающей части Т-клеточного рецептора. После того как реципиентные Т-клетки генетически модифицированы, они приобретают способность связываться с целевыми антигенами, экспрессируемыми на поверхности опухоли, распознавая их с помощью иммуноглобулиновой части химерного рецептора, CAR [11]. Одним из преимуществ этого подхода является теоретическая возможность терапии любого типа опухоли с известными специфическими поверхностными антигенами [2].

Лечение рака клеточными препаратами, состоящими из аутологичных донорских Т-лимфоцитов, трансфицированных (трансдуцированных) препаратами рекомбинантных ДНК и экспрессирующих на своей поверхности химерные рецепторы к антигенам (CAR), является сравнительно новым и перспективным подходом.

Данное исследование направлено на изучение острой токсичности нового лекарственного соматоклеточного препарата «Карплазмин-ova» с целью установления обязательных параметров безопасности нового лекарственного средства.

Методы и исследования

Исследование острой токсичности (безопасности) применения изучаемого лекарственного средства было проведено по условиям стандартных рекомендаций «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [12].

Эксперименты по исследованию острой токсичности проводились на трех видах лабораторных животных: 168 белых беспородных мышей (84 самца и 84 самки; возраст мышей к началу исследования составил 3-4 месяца, масса тела 18-20 г), 168 белых беспородных крыс (84 самца и 84 самки; возраст крыс к началу эксперимента составил 2-3 месяца, масса тела 180-220 г) и 30 кроликов породы Шиншилла (15 самцов и 15 самок возраст кроликов к началу эксперимента составлял 4-5 месяцев, масса тела 2500-3000 г). Производитель животных: Филиал «Андреевка» НЦБМТ РАМН. Животные разведены специально, и ранее не участвовали в исследованиях.

В ходе эксперимента следили за поведением животных, внешним видом, двигательной активностью, реакцией на внешние раздражители. На 14-й день после введения препарата были проведены исследования на общий и биохимический анализы крови, а также выполнена некропсия с гистологическим исследованием тканей внутренних органов. Дизайн исследования острой токсичности препарата предполагал однократное внутривенное и внутрибрюшинное введение лекарственного средства и дальнейшее наблюдение за животными. Длительность наблюдения за лабораторными животными после введения субстанции составляла 14 дней, в этот период оценивали видимые признаки интоксикации и прирост массы тела (на 5, 10 и 14 день).

Целью исследования являлось изучение острой токсичности лекарственного средства «Карплазмин-ova» при однократном, внутривенном и внутрибрюшинном введении беспородным мышам и крысам и однократном, внутривенном введении кроликам. Одна эффективная доза препарата лимфоцитов, в дальнейшем называемая “ЭД”, вводимая животному (мыши, крысе или кролику), была выбрана на основе анализа экспериментов по оценке эффективности, а также на основе данных литературных источников, и составила 106 лимфоцитов, суспендированных в 0,2 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Препарат был введен мышам и крысам в дозах: ЭД, 2хЭД, 4хЭД, 8хЭД, 14хЭД и 20хЭД соответственно; кроликам в дозах: ЭД, 2хЭД, 4хЭД, 12хЭД. Животным контрольных групп были выполнены инъекции фосфатно-солевого буфера в объеме 0,2 мл, способ введения был аналогичен опытным группам. Все исследовательские работы с лабораторными животными выполнялись в соответствии с общепринятыми правовыми и этическими нормами обращения с животными, на основе стандартных операционных процедур, принятых в организации-производстве исследований, которые соответствуют правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [13]. Эвтаназия животных проводилась ответственным лицом в соответствии с требованиями, принятыми Европейской Конвенцией.

Результаты и обсуждение

Наблюдение за животными всех групп в течение 14 дней не выявило никаких значимых изменений внешнего вида, поведения и двигательной активности. Осмотр животных после однократного введения препарата проводился на 5, 10 и 14 сутки.

Показано, что однократное внутривенное и внутрибрюшинное введение препарата «Карплазмин-ova» белым беспородным мышам, беспородным крысам в дозах до 20 х ЭД и внутривенное введение препарата кроликам породы Шиншилла в дозах до 12 х ЭД включительно не приводило к летальным исходам. Во всех исследованных группах крыс также не было отмечено признаков интоксикации.

Внутривенное введение препарата мышам в дозах ЭД и 2 х ЭД также не вызывало никаких видимых признаков интоксикации. При дозе 4 х ЭД сразу после введения наблюдалось снижение двигательной активности и одышка. При дозах 8 х ЭД, 14 х ЭД и 20 х ЭД наблюдались также судороги задних конечностей. Эти симптомы проходили в течение 5-15 минут. На протяжении последующего наблюдения в течение 14 суток в состоянии и поведении животных, приросте массы тела не наблюдалось никаких отклонений. Внутривенное введение препарата «Карплазмин-ova» кроликам в дозах ЭД, 2 х ЭД и 4 х ЭД не вызывало видимых признаков интоксикации. При введении дозы 12 х ЭД внутривенно наблюдалось снижение двигательной активности и одышка. Эти симптомы проходили в течение 5-15 минут. На протяжении последующего наблюдения в течение 14 суток в состоянии и поведении животных, приросте массы тела не наблюдалось отклонений. Результаты наблюдения животных во время введения препарата «Карплазмин-ova» приведены в таблицах 1, 2 и 3.

Табл. 1. Признаки интоксикации после однократного введения препарата «Карплазмин-ova» мышам («дефис» - признаков интоксикации не обнаружено)

Эксперимент   Контроль	Препарат Карплазмин-ova
	ЭД 2×ЭД	4×ЭД	8×ЭД      14×ЭД   20×ЭД
в/в введение      -	-         -	Снижение	Снижение двигательной
самцы		двигательной активности. Одышка.*	активности. Одышка. Судороги задних конечностей.*
в/б    введение - самцы	-         -	-	-                        -                   -
в/в введение      -	-         -	Снижение	Снижение двигательной
самки		двигательной активности. Одышка.*	активности. Одышка. Судороги нижних конечностей.*
в/б введение     - самки	-         -	-	-                        -                   -

*Симптомы проходили через 5-15 минут после введения.

Табл. 2. Признаки интоксикации после однократного введения препарата «Карплазмин-ova» крысам («дефис» - признаков интоксикации не обнаружено)

Эксперимент         Контроль	Препарат Карплазмин-ova
	ЭД    2×ЭД  4×ЭД  8×ЭД  14×ЭД 20×ЭД
в/в введение самцы     -	------
в/б введение самцы     -	------
в/в введение самки      -	------
в/б введение самки      -	------

Табл. 3. Признаки интоксикации после однократного введения препарата «Карплазмин-ova» кроликам («дефис» - признаков интоксикации не обнаружено)

Эксперимент	Контроль	Препарат Карплазмин-ova
		ЭД	2×ЭД	4×ЭД	ЭД
в/в введение самцы	-	-	-	-	Снижение двигательной активности. Одышка.*
в/в введение самки	-	-	-	-	Снижение двигательной активности. Одышка.*

*Симптомы проходили через 5-15 минут после введения.

Внешний осмотр экспериментальных животных, проведенный в конце эксперимента (через 14 дней после введения субстанции), показал, что все они нормально упитаны, имеют правильное телосложение. Деформации или отека конечностей нет. Шерсть их опрятная, блестящая, плотно прилежащая к телу, без следов расчесов, изъязвлений, участков облысения и шелушения. Кожа чистая; подкожно-жировой слой развит умеренно. Зубы сохранены. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. По результатам некропсии было установлено, что внутренние органы правильно расположены, полости без выпота и спаек.

Биохимические исследования, проведенные через 14 суток после однократного внутривенного введения препарата «Карплазмин-ova» мышам и крысам в максимальной дозе 20 х ЭД, и кроликам в максимальной дозе 12 ^Х ЭД показали, что биохимические параметры крови мышей, крыс и кроликов - содержание общего белка, глюкозы, мочевины, креатинина; активность ферментов - аланинаминотрансферазы (далее по тексту АЛТ), аспартатаминотрансферазы (далее по тексту АСТ), щелочной фосфатазы и концентрация гемоглобина - для животных, получивших однократную дозу препарата «Карплазмин -ova» внутривенно или внутрибрюшинно, не отличаются от соответствующих показателей для контрольных животных. Данные гематологических исследований показали, что при внутривенном введении препарата «Карплазмин-ova» мышам в дозе 20 * ЭД повышается общее содержание лейкоцитов и изменяется лейкоцитарная формула крови, в то время как содержание эритроцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов не отличаются от соответствующих показателей для контрольных животных. При введении препарата «Карплазмин-ova» крысам внутривенно и внутрибрюшинно, мышам внутрибрюшинно и кроликам внутривенно гематологические показатели не отличались от соответствующих показателей для контрольных животных.

На основании «Руководства по проведению доклинических исследований» [12] были проведены патоморфологические исследования только для животных, получивших препарат «Карплазмин-ova» в максимальной дозе.

Выводы

Полученные результаты наблюдений, проведенных анализов крови животных и результаты патологоанатомических исследований позволили сделать вывод, что однократное внутривенное и внутрибрюшинное введение препарата «Карплазмин-ova» в лекарственной форме суспензии клеток генно-модифицированных Т-лимфоцитов в дозе 20 х ЭД не оказывает никакого токсического действия на белых беспородных крыс и белых беспородных мышей, а в дозе 12 х ЭД на кроликов породы Шиншилла, за исключением незначительных внешних признаков интоксикации (снижение двигательной активности, одышка), которые проходят в течение 5-15 минут после введения, а также повышения общего содержания лейкоцитов и изменения лейкоцитарной формулы у мышей, получивших препарат в дозе 20 х ЭД внутривенно.

Вклад авторов. О.Б. Князева: анализ результатов, написание текста статьи; Т.М. Кулинич: концепция и планирование исследования, проведение экспериментальной части; Я.Ю. Киселёва: проведение экспериментальной части исследования, анализ результатов, правка текста статьи; А.М. Шишкин: планирование хода исследования, проведение экспериментальной части исследования; В.К. Боженко: концепция и планирование исследования, анализ результатов, корректировка рукописи. Все авторы прочитали и согласились с версией рукописи, представленной для публикации.

Финансирование. Публикация подготовлена в рамках Государственного задания № 1022040800109-5-3.2.21

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Все исследования проведены с соблюдением требований, регламентирующих проведение экспериментальных работ с использованием лабораторных животных