Исследование рисков контаминации зерновых культур микотоксинами токсигенных плесеней

Для достижения стабильности качества при получении продуктов переработки зерна (продуктов питания и кормов) необходимо учитывать тот факт, что на зерноперерабатывающие предприятия, как правило, поступают партии зерна, отличающиеся по своим технологическим параметрам и показателям безопасности. В этих условиях производитель (предприятия перерабатывающей промышленности и пищевой индустрии), сохраняя сырьевые ресурсы, может осуществлять только корректирующие операции.

Безопасность зерна, предназначенного как для пищевых, так и для кормовых целей, определяется, прежде всего, его микробиологической чистотой, а фактором повышенного риска являются токсигенные плесени. В настоящее время, мировым научным сообществом доказано [10, 11, 14–19], что присутствие и развитие токсигенных плесеней в составе эпифитной микрофлоры зерна пшеницы приводит к высокой контаминации продуктов переработки микотоксинами, количество которых определяют технологии переработки (как возможные провокационные факторы). В большинстве технологических процессов переработки зерна используется гидротермическая обработка, которая является активатором для развития микроорганизмов, в том числе токсигенных плесеней.

Изменение влажности зерна при хранении, а также во время переработки в пределах от 12 до 25 %, на основании исследований ГНУ ВНИИЗ приводит к увеличению количества плесеней в 75 000 раз [1, 2, 6].

Целью данного исследования является установление рисков контаминации микотоксинами зерновых культур как факторов безопасности продуктов переработки.

Объекты и методы исследований

Для установления рисков контаминации микотоксинами продуктов переработки зерна, был определен образец зернового сырья:

– пшеница мягкая яровая ( Triticum aestivum L. ) сорта Любава, выращенная в степной зоне Брединского муниципального района Челябинской области РФ. Патент № 6160 от 15.11.2011.

Выборка образцов для исследования формировалась от партий урожая в период с 2016 по 2018 года, отобранных в агропромышленном предприятии ООО Боровое. В данном предприятии хранение зерновой массы осуществляется в металлических зернохранилищах фирмы «ROMAX» объемом 80 м³ с конусным основанием при угле наклона воронки 60° и вентилированием атмосферным воздухом. Контроль температуры и влажности зерна производился 1 раз в 5 дней в соответствии с Инструкцией № 9-7-88 по хранению зерна, маслосемян, муки и крупы.

Для получения данных о возможном влиянии температурно-влажностного режима хранения зерновой массы на изменение показателей безопасности зерна, отбор проб осуществлялся в ноябре, январе и марте каждого года проведения исследований.

Отбор проб производился в соответствии с требованиями ГОСТ 13586.3-2015. Объединенную пробу формировали из точечных проб зерна пшеницы, путем применения ручного щупа для захвата верхнего и нижнего слоев. Средняя проба формировалась исходя из массы объединенной и составляла не менее 2 кг. Отбор проб проходил в одно и тоже время суток. Общее количество исследуемых образцов составило ежегодно 41 среднюю пробу, что в общем объеме за указанный период соответствовало 123 пробам.

Влажность зерна определяли методом воздушно-тепловой сушки путем высушивания проб зерна при фиксированной температуре до постоянной массы, согласно ГОСТ 13586.5-2015.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.1594.

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) определяли по ГОСТ 31747-2012.

Количество дрожжей и плесневых грибов определяли по ГОСТ 10444.12-2013.

Для идентификации и видового типиро-вания колониеобразующих единиц использовали метод MALDI TOF MS. Посев разведений проводили глубинным методом на селективный агар для дрожжей и плесеней YGC. Анализ масс-пиковых списков спектров рибосомных белков проводили с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия).

Определение микотоксинов проводили методом тонкослойной хроматографии, согласно ГОСТ 30711-2001 (афлатоксин В1), МУ 5177-90 (дезоксиниваленол и зеараленон), МУ 3184-84, иммуноферментативным методом, согласно МУК 5-1-14/1001 (афлатоксин В1) и М 04-42-2009 (охратоксин А).

Результаты и их обсуждение

На начальном этапе исследований (в момент закладки на хранение) был проведен входной контроль качества зерна пшеницы по микробиологическим показателям и показателей безопасности (табл. 1).

Анализ полученных результатов показал, что в целом зерно пшеницы сорта Любава соответствует требованиям ГОСТ 9353-2016, а также ТР ТС 015/2011 и ТР ТС 0121/2011 и может быть использовано в качестве сырья для получения сырьевых ингредиентов.

Исследование изменений влажности и количество плесеней в исследуемых образцах зерна пшеницы в течении периода хранения (табл. 2) позволило более детально изучить динамику изменения данных показателей и выявить потенциальные риски использования данного вида сырья при переработке.

Анализ полученных данных указывает на то, что в процессе хранения влажность зерна пшеницы может значительно изменяться в сторону увеличения значений, что взаимосвязано с приростом количества плесеней. Данная динамика обусловлена, прежде всего, биологическими процессами, протекающими в зерне пшеницы, в частности процессом дыхания, при котором происходит повышение температуры и увлажнение зерновой массы. При этом значительное увеличение влажности может формировать благоприятные условия для развития токсигенных плесеней в составе эпифитной микрофлоры зерна пшеницы и, как следствие, последующее накопление микотоксинов. Важно понимать, какое количество токсигенных плесеней присутствует в общем составе, для этих целей были проведены идентификационный исследования с приме-

Таблица 1

Результаты оценки микробиологических показателей и показателей безопасности образцов зерна пшеницы сорта Любава в момент закладки на хранение (усредненные значения при входном контроле)

Наименование показателей	Регламентируемое значение, согласно ТР ТС 021/2011 ТР ТС 015/2011	Фактическое значение показателей для образцов
КМАФАнМ, КОЕ/г	Не более 5×104	(1,6 ± 0,3)×103
БГКП (колиформы)	Не допускается в 1 г	Не обнаружены в 1,0 г
Дрожжи, КОЕ/г	Не более 100	Менее 10
Плесени, КОЕ/г	Не более 50	25 ± 2
Микотоксины, мг/кг, не более
Афлатоксин В1	0,005	Менее 0,001
Дезоксиниваленол	0,7	Менее 0,2
Т-2 токсин	0,1	Менее 0,02
Зеараленон	1,0	0,065 ± 0,027
Охратоксин А	0,005	Менее 0,0025 млн–1

Таблица 2

Результаты оценки влажности и количества плесеней для образцов зерна пшеницы сорта Любава (усредненные значения по годам)

Наименование показателей Фактическое значение показателей с учетом времени года, мес. Ноябрь Январь Март 2016 год урожая Влажность, % 13,6 ± 0,2 12,0 ± 0,1 13,4 ± 0,2 Плесени, КОЕ/г 18 ± 2 22 ± 0,3 46 ± 2 2017 год урожая Влажность, % 13,8 ± 0,1 12,2 ± 0,2 13,6 ± 0,2 Плесени, КОЕ/г 14 ± 2 16 ± 2 33 2018 год урожая Влажность, % 13,8 ± 0,1 12,3 ± 0,2 13,6 ± 0,1 Плесени, КОЕ/г 16 ± 2 18 ± 2 46 ± 2 нением метода MALDI TOF MS. Данный подход позволит определить вероятностное накопление микотоксинов при технологиях использования гидротермических процессов переработки зерна пшеницы.

Использование метода MALDI TOF MS и программного обеспечения MALDI Biotyper для идентификации позволит с высокой вероятностью и точностью провести видовую идентификацию токсигенных плесеней. Методология исследования включает посев проб в разведениях (10–1,10–2,10–3) глубинным методом на селективный агар для дрожжей и плесеней YGC (Yeast extract glucose chloramphenicol agar, Merck). Инкубацию при (25 ± 1) °С на 3 и 10 сутки. Затем определяли количество колоний и отсев единичных колоний для идентификации.

Полученные методом MALDI TOF MS результаты идентификации мицелиальной микрофлоры, в том числе токсигенной (табл. 3) доказали, что в случае нарушения

Таблица 3

Результаты идентификации мицелиальной токсигенной микрофлоры зерна пшеницы, КОЕ/г (метод MALDI TOF MS) (усредненные значения)

Посев разведений глубинным методом для идентификации методом

MALDI TOF

Идентификация

MALDI TOF MS

Alternaria alternate (2,312)

Aspergillus candidus (1,918)

Fusarium spp (1,854)

Penicillium spp (1,751)

Sarocladium spp (<1,7)

Cladosporium spp (<1,7) Trichoderma spp (<1,7)

Скор согласно коэффициенту совпадения* +++ ++ ++ +

*Меню Скора с учетом коэффициента совпадения: 2,300…3,000 (+++), 2,000…2,299 (++), 1,700…1,999 (+), ...0,000…1,699 (–). Скор с величиной равной 2 и более считали надежным для определения вида (++), в диапазоне от 1,7 до 2,0 надежным для определения рода (+), показатель менее 1,7 свидетельствовал о ненадежной идентификации (–)

условий хранения зерновые массы, появляются достаточно высокие риски к накоплению микотоксинов. В этой связи, на наш взгляд, для минимизации рисков повышения активности токсигенных плесеней необходимо прежде всего установить и регулировать факторы, провоцирующие их возникновения.

На основании анализа и систематизации информации, изложенной в научной литературе [2, 5, 6, 14–19] была сформирована система оценки (см. рисунок) факторов рисков накопления микотоксинов (Афлатоксин B1, Охратоксин А, Дезоксиниваленол, Т-2 токсин и Зеараленон) токсигенными плесенями (родов Aspergillus, Alternaria, Fusarium) и способы их регулирования.

Видовая идентификация микрофлоры позволяет оценить потенциальные риски накопления микотоксинов и их патологического эффекта на организм животных и человека. Во время характеристики рисков накопления микотоксинов в пищевых продуктах, ряд исследователей [1, 2, 5, 6, 7, 10, 11], особо подчеркивают важность данного описания, где систематизируется характер и степень неблагоприятных последствий для здоровья животных и человека.

В мировой практике регламентируемые нормы допустимого уровня микотоксинов разрабатываются основываясь на принципе «факторов неопределенности» и рассчитываются с учетом уровня минимального негативного эффекта регулярного употребления загрязненных пищевых продуктов. Утвержденные ФАО/ВОЗ [3, 4, 8, 9, 12, 13] максимальные значения содержания микотоксинов получены в результате экспериментальных или эпидемиологических исследований, основанных на результатах исследований на животных, а также включают использование математических методов моделирования. Однако при значительной вариабельности безопасности зернового сырья, оценка рисков потребления продуктов, загрязненных микотоксинами, должна быть направлена на полное исключение загрязнения кормов для животных и готовых продуктов токсичными соединениями.

Таким образом, ввиду высокой степени опасностей, которые могут возникать при значительном накоплении микотоксинов в условиях активного развития токсигенных плесеней в зерновой массе, необходимо исследовать возможности их полного блокирования.