Исследование синергетического эффекта лактата кальция, протеазы и целлюлазы в технологии получения белкового гидролизата из подсолнечного шрота

П.С. Бикбулатов, , О.В. Чугунова, , Н.В. Заворохина, ,

P.S. Bikbulatov, , O.V. Chugunova, , N.V. Zavorokhina, ,

Мировое производство белков из растительного сырья в последние годы стремительно растет [1, 2]. По прогнозам, к 2027 году рынок растительных белков составит 17,4 млрд долларов, увеличившись за пять лет на 42,6 % [2, 3].

Российская Федерация утвердилась в качестве глобального лидера в агропромышленном секторе, что в полной мере относится к рынку подсолнечника. Ценность этой культуры определяется не только производством масла, но и генерацией значительных объемов вторичных продуктов переработки, ключевым из которых является подсолнечный шрот – высокобелковое сырье, представляющее стратегический интерес для переработки с целью решения задач импортозамещения и обогащения пищевых продуктов.

По данным Росстата, посевные площади подсолнечника в России демонстрируют стабильный рост и в 2023 году составили около 9,5–10,0 млн гектаров [4].

Валовой сбор семян подсолнечника в последние годы колеблется в диапазоне 15,5– 17,5 млн тонн в зависимости от агроклиматических условий. Например, в 2022 году был собран рекордный урожай – свыше 19 млн тонн, а в 2023 году – около 16,5 млн тонн [3, 5].

Объем производства шрота напрямую коррелирует с объемом переработанных семян на масло. В среднем, из 1 тонны семян подсолнечника получают около 350–400 кг масла, отходы составляют 500–550 кг шрота [6].

Согласно оценкам Масложирового Союза России, ежегодное количество подсолнечного шрота в России составляет от 8,5 до 10,5 млн тонн [7].

Значительная часть этого объема (около 70–80 %) традиционно экспортируется, в основном, в качестве кормового продукта для животноводства. Турция, Беларусь и страны ЕС являются крупнейшими покупателями.

Подсолнечный шрот, являясь побочным продуктом, обладает значительным недооцененным потенциалом для пищевой промышленности. Однако его широкое использование в пищевых целях сдерживается рядом факторов: наличие прочной фиброзной структуры клеточных стенок, низкая степень экстракции белка, присутствие антипитательных соединений, в первую очередь, полифенолов (хлорогеновой кислоты), которые окисляются с образованием хинонов, взаимодействующих с белками и ухудшающих их функциональные свойства, могут придавать горьковатый вкус и темный цвет.

Содержание белка в шроте достигает 35– 45 %, а после дополнительной обработки (очистки от оболочки, обесцвечивание) может быть получен концентрат белка с содержанием до 60–70 % [8].

Белок подсолнечника обладает хорошими эмульгирующими и гидрофильными свойствами, что делает его перспективным ингредиентом для мясных, молочных и хлебобулочных изделий.

Использование шрота, который является вторичным ресурсом, позволяет значительно снизить себестоимость конечных продуктов, обогащенных белком, создавая основу для экономики замкнутого цикла в АПК [9].

Целью данной работы является научное обоснование комбинированного использования лактата кальция, протеазы и целлюлазы в технологии получения гидролизата белка из подсолнечного шрота.

Основными задачами использования данной комбинации являлось разрушение клеточных стенок подсолнечного шрота с целью увеличения доступности растворимых белков и увеличение выхода белкового гидролизата.

Клеточные стенки подсолнечного шрота состоят в основном из целлюлозы, гемицеллюлоз и пектинов. Целлюлазный комплекс гидролизует β-1,4-гликозидные связи в целлюлозе. Это приводит к разрушению клеточных стенок, облегчает доступ воды и протеолитических ферментов к белкам, заключенным внутри клеток [10]. Увеличивается экст-рагируемость белка на последующих стадиях.

Нативные белки подсолнечника представлены в основном гелиантуином и альбуминами. Протеаза (например, нейтральная или щелочная, такая как «Протозим Н») катализирует гидролиз пептидных связей. Это приводит к повышению растворимости за счет расщепления крупных белковых агрегатов на мелкие пептиды и аминокислоты, особенно в изоэлектрической точке белка.

Гидролиз способствует улучшению функциональных свойств (эмульгирующая, пенообразующая и влагоудерживающая способности). Образование низкомолекулярных пептидов облегчает их усвоение [11, 12].

Использование лактата кальция является необходимым для предотвращения окисления полифенолов. Ионы кальция (Ca2+) способны образовывать нерастворимые комплексы с окисленными формами полифенолов (хинонами), предотвращая их необратимое связывание с амино- и сульфгидрильными группами белков. Это позволяет получить гидролизат более светлого цвета и с лучшей растворимостью [13].

Лактат кальция может участвовать в поддержании оптимального pH, необходимого для действия ферментов. Кроме того, влияет на функциональные свойства конечного продукта за счет улучшения гелеобразующией спосоности [14, 15].

Объекты и методы исследования

Объектом для получения гидролизатов стал шрот подсолнечника, полученный в результате холодного отжима масла (Тамбовская область, 2024 г.), а также гидролизаты белка подсолнечного шрота (ГБП 1, ГБП 2, ГБП 3), полученные при различных режимах ферментативного гидролиза по следующей методике.

Очищенный от примесей подсолнечный шрот измельчали до размера частиц не более 300 мкм, после чего диспергировали в воде в соотношении 1:10 для получения основной суспензии. Гидролиз белка проводили парал- лельно тремя методами с целью определения наиболее эффективного из них:

• 1)    ГБП 1 – водную суспензию выдерживали в течение 2 часов при 25 °С, после чего центрифугировали при 10000×g, 5 мин, 20° и фильтровали с последующей сушкой сухого остатка;

• 2)    ГБП 2 – водную суспензию доводили раствором 1M NaOH до pH 8,0, вносили фосфатный буфер и нагревали до t 50–55 °C, после чего вносили 0,5 % лактата кальция от массы суспензии и 1,5 % протеазы от массы измельченного подсолнечного шрота. Полученную суспензию выдерживали в течение 1,5 часов при постоянной t, после чего центрифугировали при 10000×g 5 мин при 20° и фильтровали с последующей сушкой сухого остатка;

• 3)    ГБП 3 – водную суспензию доводили раствором 10 % лимонной кислоты до pH 4,2– 5,6, после чего нагревали до 50–55 °C, вносили 1 % целлюлазы и выдерживали в течение 50–60 мин при постоянном перемешивании. Полученную суспензию центрифугировали, после чего твердую фазу отделяли с последующей сушкой и повторно диспергировали водой. Вторичную водную суспензию доводили раствором 1M NaOH до pH 8,0. Далее в ГБП 2 и ГБП 3 вносили фосфатный буфер и нагревали до t 50–55°C, после чего вносили 0,5 % лактата кальция от массы суспензии и 1,5 % протеазы от массы сухого остатка первичного гидролиза. Полученную суспензию выдерживали в течение 1,5 часов при постоянной t и перемешивании, после чего центрифугировали при 10000×g, 5 мин, 20° и фильтровали с последующей сушкой сухого остатка.

Схема проведения экспериментальной части, направленной на получение гидролизата белка подсолнечного шрота, представлена на рис. 1.

В третьем варианте благодаря предварительной деструкции клеточных стенок протеаза получает прямой доступ к белкам, что увеличивает скорость и степень гидролиза.

В работе использовали следующие стандартные методы исследования:

Массовую долю влаги определяли гравиметрически по ГОСТ 15113.4-2021. Массовую долю белка методом Кьельдаля по ГОСТ 10846-91.

Степень гидролиза (СГ) белка определяли по формуле:

( N AA - N AAo )

^{( N} OA ^- N AAo )

x 100%,

где N ОА – содержание общего азота, %; N ААо – содержание азота в негидролизованном сырье, %; N АА – содержание аминного азота в гидролизате после гидролиза в течение некоторого периода времени, % [16].

Содержание аминного азота в негидролизованном сырье и белковом гидролизате определяли методом формольного титрования (метод Серенса) по ОФС.1.2.3.0022.15. Сущность метода состоит в защите формальдегидом свободных аминогрупп (образование оснований Шиффа) и алкалиметрическом титровании эквивалентного количества карбоксильных групп.

Концентрацию общего азота определяли с реактивом Несслера по ОФС. 1.7.2.0027.15. Метод основан на способности реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, которые образуются после минерализации белковых продуктов.

Органолептические показатели – ГОСТ 15113.3-77.

Количественное определение суммы фенольных соединений в пересчете на хлоро-генновую кислоту выполняли методом спектрофотометрии. Измерения оптической плотности проводили в области спектра 200–400 нм с использованием спектрофотометра СФ-2000 (Россия). В качестве стандарта применяли хлорогеновую кислоту (Chlorogenic acid CRS, код: Y0000569, чистотой 97,1 %). Расчет осуществляли по калибровочному графику (рис. 2), построенному на основе удельного показателя поглощения стандартного раствора хлорогеновой кислоты в 70 % этаноле, в соответствии с методикой, изложенной в ФС.2.5.0019.15 [17].

Результаты и их обсуждение

Результаты физико-химических показателей образцов гидролизатов белка подсолнечного шрота (ГБП 1, ГБП 2, ГБП 3), полученные при различных режимах ферментативного гидролиза, представлены в табл. 1.

Установлено, что с увеличением степени гидролиза от 7,53 % (ГБП 2) до 12,0 % (ГБП 3) отмечается снижение общего выхода полученного гидролизата с 28,4 до 22,3 г и повышение массовой доли белка до 68,9 %. Таким образом, использование целлюлазы в общем про-

Рис. 1. Схема получения гидролизата белка подсолнечного шрота

Таблица 1

Физико-химические показатели гидролизатов белка подсолнечного шрота

Показатель	ГБП 1	ГБП 2	ГБП 3
Выход, г	32,1 ± 0,2	28,4 ± 0,2	22,3 ± 0,2
Массовая доля влаги, %	8,1 ± 0,2	7,5 ± 0,2	6,1 ± 0,2
Массовая доля белка, %	41,1 ± 0,2	50,8 ± 0,2	68,9 ± 0,2
Массовая доля аминного азот, мг/100 г	447,11 ± 22,36	466,67 ± 23,33	586,83 ± 29,34
Степень гидролиза, %	0,52	7,53	12,00
Содержание хлорогеновой кислоты, %	1,381	1,723	2,850

Рис. 2. Градуировочная зависимость для хлорогеновой кислоты

цессе гидролиза позволяет повысить общую эффективность ферментативной обработки, позволяя расщепить и удалить небелковые компоненты, снижающие общую пищевую и биологическую ценность гидролизата.

Далее изучены органолептические показатели растительных белков, полученных при различных режимах ферментативного гидролиза.

На рис. 3 приведены сравнительные сенсорные профили полученных белковых гидролизатов с указанием основных дексрипторов и их интенсивности, выраженных по 5-балльной шкале.

Наиболее индифферентным по органолептическим показателям является образец ГПБ 2, он характеризуется интенсивностью запаха ниже среднего, вкус – обволакивающий с легкой горчинкой. Хотя основные вкусы показывают низкую интенсивность, высокая насыщенность вкуса и длительное послевкусие обусловлены белковой природой продукта и его специфическим взаимодействием с рецепторами языка, создавая объемный вкус.

Органолептические характеристики гидролизатов подсолнечного белка существенно зависят от степени гидролиза (СГ), определяя их применимость в пищевых продуктах.

—•— ГПБ 1

—•— ГПБ 2

—•— ГПБ 3

Рис. 3. Сенсорные профили белковых гидролизатов, полученных из подсолнечного шрота

Наиболее значимый негативный фактор при гидролизе растительных белков – горький вкус. Образование коротких пептидов (2–8 аминокислот) с гидрофобными радикалами (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, валин, пролин) оказывают влияние на рецепторы горького вкуса на языке. Интенсивность горького вкуса зависит от типа используемых для гидролиза протеаз и степени гидролиза [19, 20].

С повышением СГ концентрация свободных аминокислот растет, усиливая вкус умами, сформированный за счет глутаминовой аминокислоты, использование которой в синергизме к инозинатом и гуанилатом дает объемный вкус и солоноватый вкус. Это может быть позитивным фактором за счет маскировки горького вкуса и возможного снижения количества хлорида натрия в рецептуре пищевого продукта.

Подсолнечный шрот содержит значительное количество полифенолов (в основном хлорогеновой кислоты). В зависимости от степени гидролиза содержание хлорогеновой кислоты увеличивается с 1,381 до 2,850 % (см. табл. 1), что связано с переходом хлорогеновой кислоты в раствор вместе с белком и влияет на усиление выраженного горького вкуса в ГБП 3 (см. рис. 3).

При контакте с кислородом воздуха и под действием фермента полифенолоксидазы полифенолы окисляются до хинонов, которые затем полимеризуются, образуя темноокра-шенные пигменты [20]. Показано, что с увеличением СГ цвет белкового гидролизата становится интенсивно коричневым, темным из-за усиления контакта полифенолов с кислородом и взаимодействия продуктов реакции Майяра (между аминогруппами пептидов и восстановленными сахарами) с полифенолами.

Выводы

Научно обоснованная комбинация лактата кальция, целлюлазы и протеазы представляет собой перспективную технологию для переработки подсолнечного шрота. Повышение степени гидролиза с 7,53 до 12,0 % приводит к снижению выхода продукта (с 28,4 до 22,3 г), но повышает массовую долю белка в нём до 68,9 %. Это подтверждает, что целлюлаза эффективно разрушает небелковые компоненты (клетчатку), удаляя балластные вещества и тем самым концентрируя белковую фракцию, что повышает пищевую и биологическую ценность гидролизата.

Влияние степени гидролиза на органолептические показатели носит нелинейный характер. Низкая степень гидролиза (3–8 %) обеспечивает максимальное сохранение нативного вкуса с минимальным проявлением

Таблица 2

Влияние степени гидролиза на органолептические показатели гидролизатов подсолнечного белка

Органолептические показатель	Степень гидролиза, %
	Низкая (3–8 %)	Средняя (8–15 %)	Высокая (>15–20 %)
	ГПБ 1	ГПБ 2	ГПБ 3
Горький вкус	Слабый	Отчетливый	Выраженный
Цвет	Светло-коричневый	Коричневый	Темно-коричневый
Растительный» тон	Умеренный	Слабый	Очень слабый
Вкус умами	Слабый	Умеренный	Выраженный