Исследование состава основных примесей зрелой бражки в зависимости от продолжительности сбраживания, расы спиртовых дрожжей и применяемых ферментных препаратов

На сегодняшний день важной задачей на спиртовых заводах является повышение эффективности работы бродильного отделения. Это возможно улучшением качества спиртовых дрожжей и расширением ассортимента используемых ферментов. Традиционно в спиртовой отрасли использовали одну расу дрожжей, которая обеспечивала достаточную скорость брожения, стабильный выход спирта [1–4]. Перспективные направления развития технологии производства этанола решают следующие задачи: повышение концентрации сухих веществ перерабатываемых сред, обеспечение снижения себестоимости этанола за счет экономии сырья, электроэнергии и топлива, проведение процесса брожения при повышенных температурах и повышенной крепости в бражке. В таких условиях необходимо использование рас дрожжей, обладающих термостабильностью, осмофильностью и высокой бродильной активностью. Поэтому селекционные работы по скринингу активных рас дрожжей, выбор оптимальных режимов сбраживания концентрированного сусла являются перспективным направлением совершенствования технологии производства спирта. Массообменные процессы, протекающие между дрожжевой клеткой и питательной средой в процессе брожения, во многом определяются концентрацией питательной среды. Поскольку высокое осмотическое давление оказывает угнетающее действие на жизнедеятельность дрожжей, то при сбраживании сред повышенной концентрации предъявляются высокие требования к составу сбраживаемой среды и к дрожжам, которые должны быть осмо-, спирто- и кислотоустойчивыми [5].

Для нормальной жизнедеятельности дрожжевой клетки необходимо обеспечить в среде, с одной стороны, достаточное количество элементов питания, а с другой – содержание в среде ряда витаминов и микроэлементов для их усвоения [7, 9].

Для нормальной жизнедеятельности в анаэробных условиях дрожжам, как и другим микроорганизмам, необходим азот, который дрожжи способны усваивать в различных формах [6, 8].

Источником азотистого питания дрожжевых клеток являются растворимые соединения азота: органические и неорганические. Для поддержания своей жизнедеятельности дрожжи, с одной стороны, как автотрофы могут синтезировать все аминокислоты, используя неорганические формы азота, или, с другой стороны, использовать уже имеющиеся в сусле аминокислоты. Из общего количества азота, необходимого дрожжам, 70% они ассимилируют в виде аминокислот, остальные в виде аммония, амидного азота и пептидов. Поэтому при брожении содержание азотистых веществ в сусле уменьшается на 1/3 [10–12].

Таким образом, для обеспечения интенсивного размножения дрожжевых клеток и их высокой бродильной активности необходимо обеспечить в бродящей среде достаточное количество азотистого питания.

Наиболее рациональным решением проблемы обогащения осахаренного сусла свободными аминокислотами является гидролиз собственных белков зерновых культур протеолитическими ферментными препаратами.

Материалы и методы

В ходе исследований применялись три расы дрожжей, используемые в виде чистой культуры: XII, 987-О5, К-81:

─ термотолерантная раса К-81 (полученная КТИПП и ВНИИПБТ);

─ гибридная раса дрожжей 987 – О5, используемая в виде чистой культуры (получена из центральной лаборатории ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии);

─ Saccharomyces cerevisiae расы XII.

Концентрацию растворимых сбраживаемых углеводов, суммарного содержания сбраживаемых углеводов, несброженных углеводов и концентрации нерастворенного крахмала находили колориметрическим антроновым методом; измерение оптической плотности проводили на фотоэлектроколориметре КФК-3 [10].

Интенсивность брожения оценивали по количеству диоксида углерода, выделявшегося в единицу времени из определенного объема среды. Количество углекислоты устанавливали по убыли веса сосуда, снабженного затвором [9].

Определение концентрации побочных и вторичных метаболитов спиртового брожения проводили газохроматографическим методом (ГОСТ Р 51652–2000).

Технология получения концентрированного сусла с использованием ферментных препаратов различного действия представлена в предыдущих работах [1, 7].

Результаты и обсуждение

Для выявления параметров сбраживания сусла с повышенным содержанием сухих веществ, исследовали динамику накопления летучих примесей, варьируя норму засева дрожжей и продолжительность сбраживания при использовании дрожжей расы 987-О5. Выявили, что качественный состав примесей (таблица 1) в бражке, полученной из высококонцентрированного сусла, зависит как от продолжительности сбраживания, так и от нормы засева дрожжей.

Так, в зависимости от продолжительности процесса сбраживания, содержание ацетальдегида увеличивается (с 613,17 мг/дм3 к 54 ч до 1724,6 мг/дм3 к 72 ч), количество этилацетета снижается (с 409,2 мг/дм3 к 54 ч до 207 мг/дм3 к 72 ч), содержание метанола к 54 ч при норме засева дрожжей 15 млн клеток на 1 см3 сусла составило 0,0043 мг/см3, тогда как к 72 ч сбраживания при той же норме засева дрожжей – 0,0070 мг/дм3, количество 1-пропанол и 1-бутанол снижается с 903,14 мг/см3 и 6,38 мг/см3 – 54 час до 880 мг/см3 и 5,57 мг/см3 – к 72 ч соответственно. Минимальное содержание изобутанола вне зависимости от продолжительности сбраживания составило

900–1100 мг/см3 при норме засева дрожжей 15 млн клеток на 1 см3 сусла, количество изо-амилола возрастает с 1219,08 мг/дм3 (54 ч) до 2673,84 мг/дм3 (72 ч). Выявили, что наименьшее суммарное количество примесей получено при норме засева дрожжей 15 млн клеток на 1 см3 сусла при продолжительности сбраживания 54 ч. Установлено, что максимальное содержание этилового спирта в бражке при минимальном накоплении в ней летучих примесей соответствует варианту: продолжительность сбраживания – 54 ч при норме задачи дрожжевых клеток – 15,0 млн/см3 сусла.

Таблица 1.

Сравнительный анализ содержания основных примесей в бражке

Table 1.

Comparative analysis of the content of the main impurities in the brew

Основные примеси, мг/дм3 безводного спирта Main impurities, mg/dm3 anhydrous alcohol	Норма засева дрожжей, млн клеток на 1 см3 сусла | Yeast sowing rate, million cells per 1 cm3 wort
	12,5	15,0	17,5	12,5	15,0	17,5	12,5	15,0	17,5	12,5	15,0	17,5
	Продолжительность сбраживания, час | Fermentation duration, hour
	54			60			66			72
Ацетальдегид | Ethyl aldehyde	613,17	634,11	742,36	646,53	714,08	876,54	883,15	1085,4	1443,38	1346	1378	1724,6
Этилацетат | ethyl acetate	423,3	409,2	246,14	387,18	382,53	232,37	319,84	304,50	213,85	328,70	348,17	207,42
Метанол | Methanol	0,0050	0,0043	0,0060	0,0055	0,0050	0,0063	0,0060	0,0059	0,0068	0,0065	0,0070	0,0075
1-Пропанол | 1 Propanol	914,71	903,14	801,36	942,10	953,13	825,83	803,17	763,41	889,01	862,65	880,38	921,28
Изобутанол | Isobutanol	1343,05	1171,76	1213,18	1294,99	1002,15	1196,59	1034,41	942,15	1301,18	1157,26	1124,61	1368,21
1-Бутанол | 1 Butanol	6,91	6,38	6,22	6,73	6,06	5,81	5,92	5,97	5,96	5,87	5,57	5,95
Изоамилол | Izoamilol	1219,08	1273,61	1522,13	1841,02	2042,20	2171,92	2067,08	1987,02	2556,84	2183,48	2285,21	2673,84
Суммарное количество примесей Total amount of impurities	4516,35	4409,32	4521,246	5123,04	5100,82	5306,99	5101,63	5085,58	6385,90	5876,80	6015,02	6896,31

Изучали процесс интенсификации сбраживания концентрированного сусла с учетом внесения комплекса ферментов амилолитического, гемицеллюлазного и протеолитического действия. Определяли зависимость выхода этанола, содержания летучих примесей, содержания редуцирующих веществ в зависимости от различных рас дрожжей при норме засева 15 млн клеток на 1 см 3 сусла. Полученные данные представлены в таблице 2.

При получении стандартного сусла (контроль) использовали ферментные препараты разжижающего и осахаривающиего действия и исследовали состав концентрированного сусла, полученного при внесении в водно-мучнистую суспензию пшеницы протеолитического ферментного препарата Протоферм FP, а также протеолитического, но и целлюлолитического действия. В качестве источника ферментных препаратов целлюлотического действия использовали Висколазу 150 L. Процесс сбраживания осуществляли при температуре 32–33 °С, с использованием дрожжей расы 987-О5, норма внесения дрожжей составляла 15 млн/см3.

Анализируя данные таблицы, видим, что содержание редуцирующих веществ в бражке, полученной с использованием дрожжей К-81 и 987-О5, соответствовало норме уже к 60 ч сбраживания (0,36–0,39 г./100 см3) при совместном использовании ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитического действия, тогда как при применении XII расы дрожжей к 66 ч сбраживания этот показатель составил от 0,81 до 0,66 г./100 см3.

полученное при использовании не только

Таблица 2.

Влияние ферментных препаратов различного действия на показатели бражки, полученной из высококонцентрированного пшеничного сусла с использованием различных рас дрожжей

Table 2.

The effect of enzyme preparations of various actions on the performance of brew obtained from highly concentrated wheat wort using different yeast races

Расы дрожжей Races yeast	Варианты сусла* Wort	Редуцирующие вещества, г/100 см3 Reducing agents, g/100 ml				ОРВ, г/100 см3 ORV, g/100 ml		Выход этанола, дал/т. у.к. Ethanol yield, dal/t			Суммарная концентрация основных примесей, мг/см3 Total concentration of main impurities, mg/ml
		Продолжительность сбраживания, ч | Duration, h
		48	54	60	66	54	60		54	60	54	60
К-81	I	5,71	0,72	0,47	0,44	0,56	0,50		65,0	65,4	5356,8	6562,2
	II	5,46	0,66	0,43	0,40	0,51	0,49		65,5	65,9	4938,1	6152,3
	II	5,2	0,53	0,39	0,37	0,44	0,42		66,2	66,4	4579,5	5211,6
XII	I	6,8	1,2	0,9	0,81	1,8	0,92		63,6	63,9	6613,0	8059,7
	II	6,52	0,97	0,82	0,77	0,93	0,88		63,8	64,6	52086,7	7500,3
	II	6,41	0,9	0,71	0,66	0,82	0,75		64,1	65,2	5169,2	7354,9
987-О5	I	5,8	0,68	0,46	0,40	0,56	0,53		65,3	65,5	5006,8	6135,2
	II	5,6	0,52	0,40	0,38	0,52	0,49		65,8	66,1	4728,6	5849,3
	II	5,0	0,47	0,36	0,34	0,48	0,45		66,4	66,7	4273,5	5011,7

* I – Контроль (без протеаз и целлюлаз) Control (no proteases and cellulases) ; II – Протоферм FP Protoferm FP ; III – Протоферм

FP + Висколаза 150L Protoferm FP+Viskolaza 150L

Установлено, что термотолерантная раса 985-О5 более активно размножается, интенсивно ассимилирует углеводы, и уже к 54–60 ч брожения процесс практически прекращается: выход спирта составляет 66,6 дал/т.у.к. крахмала, к 66 ч – 66,9 дал/т.у.к. При использовании расы К-81 и XII выход этанола составил 66,2 дал/т.у.к. крахмала и 65,2 дал/т.у.к. соответственно. Причем максимальный выход спирта наблюдали при использовании сусла, в ходе получения которого были использованы и Протоферм FP и Висколаза 150 L.

Установлено, что состав сусла, используемая раса дрожжей и продолжительность сбраживания существенно влияют как на суммарное количество примесей, так и на их состав. Однако применение полного комплекса ферментов наряду с увеличением выхода спирта способствовало снижению образования побочных метаболитов, сопутствующих синтезу этанола. Так, концентрация общих примесей при сбраживании концентрированного сусла, полученного по механико-ферментативной схеме с использованием только ферментов амилолитического действия, к 54 ч сбраживания составила 5356 мг/дм3, к 60 ч 6562 мг/дм3 при использовании дрожжей расы К-81; 6613 мг/дм3 и 8059 мг/дм3 при использовании дрожжей расы XII; 5006 и 6135 мг/дм3 при использовании дрожжей расы 987-О5. Присутствие в комплексе ферментов протеолитического и гемицеллюлазного действия позволило уменьшить образование побочных метаболитов более чем в 1,5 раза – до концентрации 4273– 5000 мг/см3 при использовании расы дрожжей 987-О5 в основном за счет синтеза высших спиртов альдегидов и сложных эфиров. Использование полного комплекса ферментов при подготовке сырья к сбраживанию позволяет улучшить качество целевого продукта – этанола. Установлено, что комплекс ферментов амилолитического, гемицеллюлазного и протеолитического действия обеспечивает наибольший выход спирта с одновременным снижением образования побочных метаболитов, сопутствующих синтезу этанола.

Обогащение сусла легко ассимилируемыми компонентами азотистого питания позволит увеличить скорость размножения дрожжей, повысить плотность дрожжевой популяции и бродильную активность. Вероятно, это связано с обогащением сусла легко ассимилируемыми компонентами азотистого питания, которые используются дрожжевыми клетками непосредственно для построения биомассы. Интенсификацию синтеза белка и активирование содержащихся в дрожжевой клетке ферментов способствует интенсификации развития и размножения дрожжей.

При обеспечении дрожжей азотистым питанием биосинтез белков клетки происходит преимущественно за счет ассимиляции аминокислот среды. Таким способом экономится сахар на построение биомассы дрожжей, углеводы расходуются в основном на анаэробное дыхание и, следовательно, на образование спирта.

Можно говорить о том, что при сбраживании сусла увеличение выхода спирта, обогащённого продуктами протеолиза растительного белка, зависит от проведения более экономичного процесса, повышения степени биоконверсии углеводов в этанол, сокращения потерь крахмала на образование побочных метаболитов.

Изучали динамику сбраживания сусла дрожжами расы XII, К-81, 957-О5. В ходе сбраживания исследовали изменение несброженных углеводов и этанола. Полученные данные приведены на рисунках 1, 2.

Рисунок 1. Зависимость содержания несброженных углеводов в бражке от расы дрожжей

Продолжительность сбраживания, ч

Fermentation duration, h

Рисунок 2. Зависимость изменения концентрации этанола в бражке от расы дрожжей

Figure 2. Dependence of unbreached carbohydrates in the mash on the race of yeast

Как видно из рисунков лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас К-81 и 987-О5. Так, содержание несброжен-ных углеводов (РВ) к 54 ч брожения составило 0,65 мг/100 см 3 при сбраживании дрожжами расы К-81 и 0,5 мг/100 см3 при сбраживании дрожжами расы 987-О5, тогда как при сбраживании XII расой содержание несброженных углеводов – 1,1 мг/100 см3. На 66 ч сбраживания при использовании рас К-81 и 987-О5 количество РВ составило 0,40 и 0,35 мг/100 см3 соответственно, и 0,60 мг/100 см3 при применении XII расы, а этанола – 10,8 и 11,2% об., соответственно. Установлено, что при использовании XII расы процесс сбраживания идет с увеличением накопления спирта в бражке на протяжении всего времени исследований и достигает своего максимума к 60–66 ч – 10,7% об., тогда как при использовании рас 987-О5 и К-81 наивысшее содержание спирта достигается в бражке к 54 ч сбраживания – 11,12 и 11,1% об. соответственно.

Процесс сбраживания концентрированного сусла анализировали с учетом изменения основных технологических показателей, содержания спирта и побочных метаболитов дрожжей. Известно, что сбраживание концентрированного сусла можно осуществлять при повышенных температурах (около 32–35 °С).

Дрожжи при повышенных температурах теряют свою физиологическую активность, что приводит к снижению их конкурентоспособности к посторонней микрофлоре, и как следствие образованию посторонних метаболитов. Поэтому изучали влияние температуры сбраживания на метаболизм дрожжей рас XII, К-81 и 987-О5. Сбраживание осуществляли в течение 48–72 ч при температурах: 28–30 °С и повышенных 32–33 и 35 °С (таблица 3).

Таблица 3.

Зависимость физиологической активности различных рас дрожжей от продолжительности сбраживания

Table 3.

Dependence of unbreached carbohydrates in the mash on the race of yeast

Т брожения, °С T fermentation, ° С	Расы дрожжей yeast races	Количество дрожжей, млн/см3 | Amount of yeast, ppm/cm3
		24 ч (hours)		48 ч (hours)			72 ч (hours)
		Всего total	почк. budding	Всего total	почк. budding	мерт. dead	Всего total	мерт. dead	почк. budding
28–30	К-81	97	14	138	16	1,7	96	6	1
	987-О5	115	18	142	22	1,0	100	4	1
	XII	88	10	127	12	3,0	80	15	0
32–33	К-81	148	18	175	22	2,0	103	7	1
	987-О5	146	20	184	24	1,5	112	8	2
	XII	121	17	150	19	5	81	30	0
35	К-81	62	15	98	10	5	80	25	0
	987-О5	78	14	104	11	2,5	85	20	1
	XII	54	12	79	8	8	60	44	0

Физиологическое состояние дрожжей при температуре 28–30 и 32–33 °С можно оценить, как хорошее. К 24 ч сбраживания наблюдали в среднем: общее содержание дрожжей составило 97–146 млн/см3, почкующихся 14–20 млн/см3, к 48 ч общее количество дрожжей и содержание почкующихся дрожжей увеличилось на 26–42%. Так, к 48 ч брожения при температуре 28–30 °С максимальное количество дрожжевых клеток наблюдали при использовании расы дрожжей 987-О5. Оно составило: общее – 142 млн/см3, почкующихся – 22 млн/см 3, а минимальное при использовании расы XII: общее содержание дрожжевых клеток составило 127 млн/см3, почкующихся 12 млн/см3. При увеличении температуры до 32–33 °С содержание общих и почкующихся дрожжей возросло до 150–184 млн/см3 и 22–24 млн/см3 соответственно. К 72 ч сбраживания при температуре 28–30 °С при использовании К-81 и 987-О 5 количество мертвых клеток составило 4–6%, против 1,0–1,7% к 48 ч, для расы XII 15% против 3% к 48 ч. Увеличение температуры до 32–33 °С не привело к существенному изменению физиологического состояния дрожжей. Но когда температура брожения была повышена до 35 °С, это существенно отразилось на физиологической активности дрожжей и более резко выявило их различие. При использовании XII расы снизилась способность дрожжей к размножению, их упитанность, вырос коэффициент гибели клеток и к 48 ч сбраживания составил 8% против 2,5% у расы 987-О5, а к 72 ч – 44% против 20–25% у рас К-81 и 987-О5.

Определено влияние различных факторов на процесс сбраживания концентрированного сусла после выделения глютена. Доказано, что использование расы 987-О5 и внесение протеолитических ферментных препаратов Протоферм FP и Висколаза 150L в водно-мучнистую суспензию пшеницы позволяет сократить длительность брожения с 72 до 54 ч, увеличить выход этанола с 9,1 до 11,1% об., снизить содержание несброженных углеводов с 0,7 до 0,4 г / 100 см3, а также в 1,5–2 раза снизить образование побочных метаболитов, сопутствующих синтезу этанола, и повысить концентрацию аминного азота в сусле в 2 раза.

Обогащение сусла аминокислотами в результате протеолиза белков сырья под их действием активизирует жизнедеятельность дрожжевых клеток, что приводит к повышению содержания почкующихся клеток, увеличению интенсивности процесса сбраживания сусла, глубокому сбраживанию углеводов с одновременным увеличением выхода спирта.

Увеличение выхода спирта можно также объяснить и тем, что в результате обогащения питательной среды свободными аминокислотами сокращается расход сбраживаемых углеводов на синтез биомассы дрожжей и образование вторичных продуктов брожения, главным образом, высших спиртов. Это происходит из-за прямой ассимиляции аминокислот из окружающей среды без их дезаминирования. Содержащиеся в сбраживаемой среде углеводы расходуются преимущественно на анаэробное дыхание дрожжей, и, следовательно, на образование этилового спирта.