Исследование уровня экспрессии гена TERT в слизистой оболочке толстой кишки при различной патологии

В Российской Федерации колоректальный рак (КРР) занимает 3-е место по онкологической заболеваемости населения и 2-е место по смертности среди обоих полов.

При этом за последние 10 лет прирост заболеваемости составил 24% [1]. Высокую вероятность развития КРР имеют пациенты, страдающие воспалительными заболеваниями толстой кишки (ТК), с семейной предрасположенностью к данной форме рака и/или имеющие аденоматозные полипы толстой кишки. Частота случаев развития рака из ворсинчатых аденом более 2 см в диаметре составляет 35 – 53%, а при аденомах диаметром более 3 см вероятность их малигнизации приближается к 100% [2]. Оценка вероятности малигнизации аденоматозных полипов ТК в настоящее время проводится на основании их размеров, количества и морфологических характеристик. Актуальным является поиск молекулярных маркеров, которые могут предоставить информацию о канцерогенном риске прогрессии аденомы [3, 4]. Одним из наиболее перспективных маркеров ранней диагностики рака толстой кишки, способных выявлять заболевание с высокой чувствительностью, специфичностью и дифференцировать патологический процесс, является фермент теломераза и соответствующий ген TERT, кодирующий белок теломеразную обратную транскриптазу, входящую в состав фермента теломеразы. Активация экспрессии теломеразы является наиболее распространенным молекулярным маркером онкогенеза и выявляется в 85 – 90% всех опухолей [5].

Активность теломеразы практически отсутствует в нормальных соматических клетках и тканях человека и выявляется за редким исключением: ее наличие обнаружено в быстро обновляющихся тканях, например, в некоторых клетках крови, кишечном эпителии и базальном слое клеток кожи, а также в репродуктивных тканях [6, 7]. В подавляющем большинстве работ в качестве образца сравнения используют морфологически неизмененные ткани (МНТ) края резекции пациента с КРР [8, 9]. Недавние работы [10 – 12] продемонстрировали, что морфологически неизмененная ткань пораженного органа не может использоваться в качестве контроля при оценке молекулярных изменений. При сравнении МНТ и нормальной ткани здоровых доноров выявлены существенные молекулярно-генетические отличия, которые показали необходимость использования в качестве референсных-контрольных тканей морфологически неизмененные ткани здоровых доноров. При сравнении только опухолевых и морфологически неизмененных тканей органа, пораженного злокачественной опухолью (часто в эту группу включают ткани края резекции), многие потенциальные кандидаты опухолевых биомаркеров могут быть пропущены, а направление изменения других, наоборот, определены ошибочно.

Несмотря на обширные знания анатомии и физиологии кишечника, при злокачественном поражении толстой кишки мало учитываются особенности отдела, в котором образовалась опухоль. Очевидно, что на молекулярно-генетические характеристики опухоли оказывают влияние анатомо-физиологические особенности отделов толстой кишки, из которой она происходит. Для более полного понимания молекулярных изменений, происходящих в опухолях из разных отделов толстой кишки, необходимо знание процессов, происходящих на клеточном уровне в различных отделах толстой кишки у здоровых людей.

Целью работы явилось проведение сравнительного анализа экспрессии молекулярногенетического маркера пролиферативной активности гена TERT при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки в разных отделах толстой кишки при использовании в качестве референсных значений уровня экспрессии в неизмененной слизистой толстой кишки здоровых доноров.

Материалы и методы

Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, для всех лиц, включенных в исследование, получено информированное добровольное согласие.

Проведен анализ образцов послеоперационного материала 230 пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом «колоректальный рак», проходивших обследование и лечение в ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России в период с 2011 по 2018 год.

С доброкачественной патологией обследован 21 пациент. Ткань здоровых доноров получена от 43 пациентов. Всего исследовано 676 образцов ткани (Табл. 1).

Таблица 1. Распределение исследуемых образцов по типам тканей и морфологическим характеристикам

Группа	Количество образцов	Морфологическая характеристика ткани	Описание образцов
“Норма”	n=174	Морфологически неизмененная слизистая   толстой кишки    здоровых доноров	Образцы    получены    в    ходе профилактической колоноскопии от доноров без патологии в ТК.
“МНТ края резекции”	n=230	Морфологически неизмененная ткань края резекции	Образцы получены из зоны на расстоянии 15 – 20 см от опухолевого узла, отсутствие злокачественных клеток при гистологическом исследовании.
“КРР”	n=193	Ткань аденокарциномы, получена  из  зоны роста опухоли	Образцы аденокарцином (G1 – G3), I-IVB                          стадия. Высокодифференцированные аденокарциномы – 48%, умеренно дифференцированные    –    45%, низкодифференцированные – 7%.
“МНТ аденомы”	n=58	Морфологически неизмененная ткань при аденомах ТК	Образцы морфологически неизмененной ткани слизистой ТК, взяты на расстоянии не менее 10 см от аденомы.
“Аденома”	n=21	Ткань тубулярных и тубулярноворсинчатых аденом	Образцы  тубулярной  аденомы  с дисплазией 1 – 2

Получение образцов групп МНТ было сопряжено с определенными техническими трудностями, связанными с особенностями хирургического подхода в зависимости от локализации опухоли. При расположении опухоли в прямой кишке образцы МНТ получены из сигмовидной кишки (левой половины ободочной кишки); при расположении опухоли в нижней и средней трети сигмовидной кишки, взятие МНТ проводили из верхней трети сигмовидной кишки (левой половины ободочной кишки); при опухоли, расположенной в верхней трети сигмовидной кишки, нисходящей ободочной и селезеночном углу ободочной кишки, образцы МНТ были получены из поперечно -ободочной кишки (проксимальная часть левой половины ободочной кишки); при опухоли расположенной в поперечно-ободочной кишке, взятие МНТ проводили из сигмовидной кишки при выполнении левосторонней гемиколэктомии; при расположении опухоли в печеночном углу, восходящей ободочной кишке, слепой кишке пациентам проводилась правосторонняя гемиколэктомия и образцы МНТ были получены из поперечно-ободочной кишки (дистальная часть правой половины ободочной кишки).

Средний возраст пациентов составил 60,9 лет и не имел достоверных отличий в сравниваемых группах.

Образцы биологического материала после получения немедленно помещали в стабилизирующий раствор (EverFresh RNA, «Sileks», Россия) для сохранности нуклеиновых кислот и хранили при температуре -70 °С. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для постановки двухступенчатой ОТ-ПЦР использовали ген-специфические праймеры, наборы реагентов, протоколы и оборудование ЗАО «ДНК-Технология» (Россия). Реакционную смесь инкубировали при температуре 40 °С в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при температуре 95 °С в течение 5 минут. Полученную кДНК сразу использовали для постановки ПЦР в реальном времени. ПЦР-анализ выполняли в двух повторах, каждый объемом 12 мкл, по следующей программе: 15 циклов – 80 °С 5 сек, 94 °С 5 сек.; 1 цикл – 94 °С 5 мин; 50 циклов – 94 ºС 10 сек, 64 ºС 20 сек. В проведенном исследовании был определен уровень экспрессии гена TERT. Уровень экспрессии мРНК для гена определяли в относительных единицах (о. е.) согласно методике, предложенной Vandesompele с соавторами [13]. В качестве референсных использовали гены: GUSB, B2M и HPRT.

Статистический анализ проводили в программном пакете Statistica 10 (StatSoft, USA) с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа и Т-критерия Стьюдента при равномерном распределении в группах. Отличия считали статистически достоверными при р<0,05.

Результаты

Во всех образцах (n=676) был определен относительный уровень экспрессии гена TERT . Уровень экспрессии TERT отражает активность теломеразы. Для анализа полученных закономерностей нами было предложено разделить образцы внутри групп на в зависимости от анатомической локализации: восходящая ободочная кишка, поперечноободочная, нисходящая, сигмовидная, прямая кишка.

Активность теломеразы у здоровых добровольцев

Статистический анализ, проведенный при сравнении экспрессии гена TERT по Т-критерию в тканях здоровых доноров, выявил достоверные отличия (р<0,05) для разных отделов ТК по уровню экспрессии (Табл. 2). Нами было обнаружено постепенное увеличение активности теломеразы в ряду: восходящая ободочная кишка, поперечноободочная, нисходящая, сигмовидная (достоверно наиболее высокие значения), с резким падением активности в прямой кишке (Рис .2).

Таблица 2. Достоверность отличий экспрессии TERT в неизмененной слизистой здоровых доноров при парном сравнении разных отделов толстой кишки

Отделы ТК	Поперечный n= 34	Нисходящий n=34	Сигмовидный n = 42	Прямая кишка n= 35
Восходящий n=32	0,003*	0,002*	0,000*	0,207
Поперечный n= 34		0,429	0,170	0,022*
Нисходящий n=34			0,778	0,012*
Сигмовидный n = 42				0,000*

Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты (p<0.05)

Активность теломеразы при доброкачественных изменениях ТК

При исследовании активности теломеразы в морфологически неизмененных тканях при аденомах достоверные отличия для разных отделов ТК сохраняются (Рис. 2Б). Самые низкие значения получены в группах “аденомы” и “МНТ аденомы” для тканей прямой кишки, однако эти различия не достоверны (p>0,05), вероятно, в связи с малым размером группы “аденома”. При этом среднее значение экспрессии в группе «аденомы» было достоверно ниже, чем в других группах (Табл. 3).

Активность теломеразы при злокачественных новообразованиях ТК

При сравнении ткани аденокарциномы с неизмененной тканью здоровых доноров, получены достоверные отличия (р<0,05) в сигмовидной кишке (Рис. 2А). Сравнение тканей аденокарциномы в зависимости от анатомического расположения опухоли достоверных отличий не выявило. Т.о. было определено, что в неизмененной слизистой ТК здоровых доноров в разных отделах существуют достоверные отличия в уровне экспрессии TERT , которые теряются в тканях опухолей.

Рис. 2. Активность теломеразы в образцах тканей слизистой оболочки ободочной (восходящей, поперечной, нисходящей, сигмовидной) и прямой кишки (А) в группах «норма» и «опухоль», (Б) в группах «норма», «МНТ аденомы» и «аденома»

В связи с особенностями хирургического подхода в зависимости от локализации опухоли и соответствующего забора МНТ из края резекции КРР деление на пять отделов ТК при анализе не представляется возможным из-за отсутствия образцов из восходящего отдела ободочной кишки (ОК) и малого числа образцов нисходящей ОК (см. Методы).

В клинической практике, особенно в онкологии, имеет большое значение локализация патологического процесса относительно правой (восходящая ОК, проксимальная часть поперечной ОК) и левой половин ОК (дистальная часть поперечной ОК, нисходящая, сигмовидная кишка), что обусловлено различием клинической картины и, в большой степени, тактики лечения опухолей с правосторонней и левосторонней локализацией. Нами было принято решение оценить уровень экспрессии для тканей края резекции и других исследуемых тканей по трем отделам ТК (правая, левая половины ОК и прямая кишка).

Активность теломеразы в правой, левой половинах ободочной и в прямой кишке

При исследовании экспрессии гена TERT в тканях здоровых доноров нами было обнаружено, что в «норме» в левой половине ОК активность теломеразы достоверно выше, чем в правой половине ОК и в ПК (Рис. 3А, Табл. 3).

Таблица 3. Средние значения уровня экспрессии гена TERT для групп исследуемых тканей

Отделы ТК	Тип ткани	Среднее для группы
Правая половина ОК	Норма	9,21
	МНТ при аденоме	8,95
	МНТ при КРР	8,92
	Аденома	8,16
	КРР	9,05
Левая половина ОК	Норма	9,77
	МНТ при аденоме	9,25
	МНТ при КРР	8,96
	Аденома	7,58
	КРР	8,74
Прямая кишка	Норма	9,10
	МНТ при аденоме	8,17
	МНТ при КРР	8,56
	Аденома	5,38
	КРР	8,91

Во всех отделах толстой кишки образцы «нормы» продемонстрировали более высокие средние значения экспрессии теломеразы, чем другие исследованные группы тканей (Табл. 3). В случае правосторонней локализации злокачественной опухоли выявлена более высокая активность теломеразы, чем при левосторонних опухолях, в прямой кишке активность теломеразы, по сравнению с левосторонним раком возрастает (Рис. 3А, Табл. 3, 4), однако эти результаты статистически не достоверны (p>0,05). В тканях края резекции наблюдаются более низкие значения среднего уровня экспрессии теломеразы в прямой кишке по сравнению с правой и левой кишкой, однако эти данные также статистически не достоверны (p>0,05) (Рис. 3А, Табл. 3, 4). Уровень экспрессии

TERT при сравнении тканей аденокарциномы и края резекции в трех отделах ТК не имел достоверных различий.

Рис. 3. Активность теломеразы в правой половине ободочной кишки, левой половине ободочной кишки и прямой кишке (А) в группах «норма», «МНТ край резекции», «опухоль», (Б) в группах «норма», «МНТ аденомы» и «аденома»

При сравнении уровня экспрессии в группах “аденомы” и “МНТ аденомы” в трех отделах ТК самые низкие значения экспрессии теломеразы получены для тканей прямой кишки (Табл. 3). Установлено, что при доброкачественной патологии дифференциация на отделы в морфологически неизмененных тканях сохраняется.

Таблица 4. Достоверность отличий экспрессии гена TERT в разных типах ткани при группировании образцов по правой половине ободочной кишки, левой половине ободочной кишки и прямой кишки при парном сравнении отделов

Отделы толстой кишки / значение p	Тип ткани
	Край резекции	Норма	Опухоль	МНТ аденомы	Аденома
Правая ОК - Левая ОК	0,901	0,001*	0,172	0,454	0,492
Левая ОК - прямая кишка	0,121	0,001*	0,485	0, 003*	0,247
Правая ОК - прямая кишка	0,199	0,555	0,506	0,024*	0,126

Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты (p<0.05)

Показано, что уровень экспрессии гена TERT в “норме” отличается в разных отделах ТК (Табл. 2) и имеет наиболее высокие средние значения в нисходящей и сигмовидной кишке, что соответствует левым отделам ТК (Табл. 3). При парном сравнении тканей в левой половине ОК обнаружены достоверные отличия уровней экспрессии TERT между группами «Норма», «КРР» и «МНТ при КРР». Ткани аденомы отличаются от неизмененных тканей здоровых доноров во всех отделах ТК. Также во всех отделах ТК не обнаружены достоверные отличия между группами «КРР» и « МНТ при КРР» (Табл. 5).

Таблица 5. Достоверность отличий для тканей в отделах правой и левой половин ободочной кишки и в прямой кишке

Отделы ТК	Тип ткани	Норма	МНТ аденомы	Аденома	МНТ при КРР	КРР
Правая половина ОК	Норма		0,359	0,014*	0,158	0,748
	МНТ при аденоме			0,183	0,951	0,730
	Аденома				0,135	0,216
	МНТ при КРР					0,534
	КРР
Левая	Норма		0,054	0,000*	0,000*	0,000*

половина ОК	МНТ при аденоме			0,004*	0,390	0,115
	Аденома				0,007*	0,015*
	МНТ при КРР					0,297
	КРР
Прямая кишка	Норма		0,000*	0,000*	0,056	0,516
	МНТ при аденоме			0,004*	0,293	0,057
	Аденома				0,045*	0,034
	МНТ при КРР					0,238*
	КРР

Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты (p<0.05)

Обсуждение

Продукт гена TERT - обратная транскриптаза, основной функцией которой является удлинение и стабилизация теломер, также вызывает усиление пролиферации клеток, участвует в регуляции экспрессии некоторых генов и контролирует ответ на повреждение ДНК [14].

Активность/экспрессия TERT отражает скорость процессов пролиферации в ткани. Согласно большинству литературных источников уровень TERT в опухолевых тканях выше, чем в «норме» [15, 16]. В нашем исследовании уровень TERT в нормальных тканях был выше, чем при патологических процессах (КРР и аденома). Мы объясняем эти существенные различия принципиально другим подходом в формировании контрольной группы «нормальная ткань». Традиционно в большинстве исследований в качестве «нормы» используют ткань края резекции. Наши данные согласуются с результатами, представленными в ряде работ [10, 12, 17], в которых подчеркивается, что край резекции нельзя считать нормальной тканью, т.к. развитие злокачественной опухоли затрагивает и отдаленные участки пораженного органа, в данном случае ТК. Более того, наш результат объясняется особенностями нормальной физиологии тканей ТК. Скорость пролиферации клеток кишечного эпителия является одной из самых высоких в организме млекопитающих и человека. По данным Lipkin с соавторами (1963) [18] в подвздошной кишке человека скорость пролиферации составляет 0,8 клетки на 100 клеток крипт в час, в толстой кишке – 1,2 клетки на 100 клеток крипт в час. Скорость деления клеток кишечного эпителия выше, чем у клеток различных злокачественных опухолей, для которых характерен экспоненциальный рост [19], и увеличение клеточной продукции происходит скорее за счет роста числа пролиферирующих клеток, а не за счет укорочения их жизненного цикла [20]. В статье Панченко с соавторами [21] приводятся данные об оценке пролиферативной активности эпителия в разных отделах ЖКТ. Согласно этим данным митотический индекс (процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток) оказался самым высоким в сигмовидной кишке. Полученные в нашей работе данные указывают на то, что в тканях сигмовидной кишки здоровых людей наблюдаются самые высокие показатели активности теломеразы.

Возможно, снижение экспрессии теломеразы в тканях опухоли может указывать на нарушение естественных процессов клеточного самообновления. Наше исследование гена TERT показало достоверное снижение уровня его экспрессии в тканях при гиперпролиферативных заболеваниях ТК, причем наиболее резкое снижение было отмечено в тканях аденомы. Полученный результат можно объяснить включением дисрегуляторных механизмов при доброкачественной опухолевой патологии, например, преобладающую потерю транскрипционной активности в опухолевых клетках толстой кишки и усиление известных опухолеспецифических факторов: иммунного ответа, передачи сигналов Wnt, репликации ДНК, клеточной адгезии, апоптоза, репарации ДНК и др. [22]. Доброкачественные гиперпролиферативные заболевания редко рассматриваются с точки зрения их влияния на окружающие ткани [23, 24]. В то же время нами показано, что при локализации аденомы в ПК, изменения в МНТ аденомы достоверны и могут указывать на влияние аденомы на окружающие ткани или являться «средой для ее возникновения и роста».

Несмотря на обширные сведения об анатомии и физиологии кишечника, при злокачественном поражении толстой кишки мало учитываются особенности отдела, в котором образовалась опухоль. Так, опухоли толстой кишки независимо от локализации объединяют под названием «колоректальный рак». Если посмотреть на анатомофизиологические особенности толстой кишки, то становится понятным, что такой подход устарел. Несмотря на морфологическое сходство слизистой оболочки правой и левой половин ободочной кишки, они характеризуются разной всасывательной способностью, составом микробиоты и разным эмбриологическим происхождением [25]. Полученные в нашей работе результаты подтверждают этот факт. Мы продемонстрировали, что в уровне экспрессии теломеразы существуют различия между раком правой и левой половины толстой кишки. При этом, в правой половине ободочной кишки физиологические процессы оказывают наименьшее влияние на изменение экспрессии теломеразы в патологических процессах: различия между тканями здоровых добровольцев статистически не отличаются от тканей опухоли. В левой половине ободочной кишки и в прямой кишке изменения в экспрессии теломеразы зависят от типа ткани и патологического процесса. Так, в левой половине ободочной кишки ткани здоровых добровольцев отличались от всех исследованных тканей при патологии, а ткани аденомы отличались от тканей края резекции и рака. В прямой кишке ткани «нормы» отличались от МНТ при аденоме, а ткань аденомы - от аденокарциномы и края резекции.

В ряде статей [26 - 28] упоминаются различия частоты возникновения КРР в зависимости от отдела. На долю рака правосторонней локализации приходится от 15% до 39% опухолей. В нашем исследовании его доля составила 22%. Такая закономерность, может отражать разные биологические характеристики клеток проксимального и дистального отделов толстой кишки, приобретенные при эмбриональном и постнатальном развитии [29 –32]. Полученные в нашей работе значения экспрессии TERT в исследуемых группах ткани, во-первых, вносят дополнительную информацию об отличиях молекулярных процессов в тканях, окружающих злокачественную и доброкачественную опухоль, а, во-вторых, подчеркивают важность правильного выбора контроля (морфологически неизмененная слизистая толстой кишки здоровых доноров) для сравнения при анализе патологических процессов.

Полученные в ходе работы результаты, подтверждают, что развитие гиперпролиферативного процесса сопровождается изменениями, затрагивающими весь пораженный орган [33, 34]. Также показано, что молекулярно-генетические маркеры, отражают возможные пути развития заболевания, что согласуется с данными, полученными нами в других исследованиях [35, 36], подчеркивают важность и необходимость дальнейшего изучения биомаркеров в целях профилактики возникновения и снижения заболеваемости злокачественными новообразованиями.

Заключение

Проведенное исследование экспрессии гена TERT показало, что в морфологически неизмененной слизистой толстой кишки здоровых доноров уровень экспрессии выше, чем в аденокарциноме, аденоме и в морфологически неизмененных тканях толстой кишки, расположенных на расстоянии от опухолевого узла, при злокачественных и доброкачественных новообразованиях.