Исследование возможности применения пробиотического штамма L. plantarum в технологии полутвердого сыра

Введение. Сыр – это богатый питательными веществами продукт, содержащий основные питательные вещества, белки, жиры, витамины и минералы, он играет важную роль в удовлетворении питательных потребностей человека при соблюдении меры. Производство твердых и полутвердых сыров включает фазу созревания, которая может длиться разное время. Созревание является сложным процессом, который включает различные биохимические изменения: гидролиз липидов, метаболизм лактозы, распад белка в сочетании с микробиологическими изменениями [1, 2]. Основным катализатором этих превращений служат заквасочные микроорганизмы, а также собственная микробиота молока, молочные ферменты, коагулянты и вторичные микроорганизмы, такие как плесень и дрожжи. В процессе сыроварения могут быть использованы различные заквасочные культуры, но особо популярны закваски на основе Lactococcus lactis ssp. lactis , Lc. lactis ssp .

cremoris, Streptococcus thermophilus и Lactobacillus helveticus (FD-DVS RSF-736, Chr.Hansen A/S, Hørsholm, Дания) с некоторыми с модификациями [3]. В процессе созревания сыра молочные белки подвергаются ферментации молочнокислыми бактериями, в результате которой образуются различные биоактивные пептиды, в т. ч. пептиды-ингибиторы ряда ферментов, иммуномодулирующие пептиды, антимикробные и антиоксидантные пептиды [4]. На уровне геномных исследований в подавляющем большинстве случаев сыров, имеющих стадию созревания, наблюдается следующая тенденция. В сырах молочнокислые бактерии, используемые в качестве закваски, при созревании постепенно заменяются на незаквасочные молочнокислые бактерии, в основном на мезофильные лактобактерии, лейконосток, педио-кокки и энтерококки, источником которых является используемое молоко, а также среда и инвентарь сыродельни. Эти микроорганизмы в разной степени присутствуют в жизнеспособной микробиоте сыров во время созревания за счет их способности использовать, помимо остаточной лактозы, другие доступные питательные вещества, такие как пентозы, углеводы из гликозилированных пептидов κ-казеина и мембран жировых глобул, цитрат, пептиды и аминокислоты [5].

Цель исследования – изучить влияние незаквасочного пробиотического штамма Lactipla-ntibacillus plantarum FCa3L на комплекс показателей качества полутвердого сыра.

Задачи: оценка сыров, изготовленных с классической закваской и закваской, в которую добавлен пробиотический штамм, по следующим параметрам: химические, структурномеханические, органолептические и антиоксидантные.

Объекты и методы. Влияние штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L (ранее этот штамм был описан как пробиотический [14]) изучали в модели полутвердого сыра. Изготовление сыра проводили по ранее описанному методу [15]. Использовали сырое коровье молоко со следующими характеристиками: 3,3 % белка; 4 % жира; 4,15 % лактозы, данные получены с помощью «Клевер-2М» (Россия). Предварительно пастеризованное молоко (75 °C, 30 с) охлаждали до 40 °C, добавляли заквасочную культуру CHOOZIT™ (Danisco, Франция), пробиотический штамм L. plantarum FCa3L (варианты сыров приведены в табл. 1), оставляли на ферментацию на 60–90 мин.

Таблица 1

Компонент рецептуры	Контроль	L. plantarum FCa3L
Сырое коровье молоко, л	4	4
Жидкая коммерческая закваска CHOOZIT™, мл	5	–
Жидкая закваска L. Plantarum, мл	–	5
Коммерческая закваска CHOOZIT™, г	0,07	0,07
Жидкий сычужный фермент, мл	0,12	0,12
Раствор хлорида кальция (10 %), мл	4	4

Рецептура сыра полутвердого

Semi-hard cheese recipe

После ферментации и снижении рН на 0,2 ед., добавляли сычужный фермент (50000 ед.) (ООО «Современные технологии», г. Радужный, Рос- сия). Смесь оставляли для коагуляции при температуре 35 °C на 40 мин, затем молоко оставляли в покое до образования прочного сгустка. Получив- шийся сгусток разрезали стерильным творожным ножом на кусочки размером 1 × 1 × 1 см, полученную массу оставляли в покое на 15–30 мин, затем отделяли сыворотку. Зерно перекладывали в формы, самопрессовали в течение 2 ч, затем прессовали под давлением, ставили отдыхать в холодильник на 12 ч. Сыры извлекали из форм, посол осуществляли в рассоле и далее отправляли на созревание в течение 45 дней при температуре 12 °C, влажности воздуха 75–80 %, анализ качества сыра проводили через 3 дня и далее каждые две недели.

Химический состав сыра, цветность определяли как описано ранее [15].

Органолептическая оценка сыра проводилась через 45 дней после созревания. Сыры разрезали на кубики размером ~2 × 2 × 2 см3. Затем образцы помещали на пластиковые тарелки и кодировали случайными двузначными номерами. Гедонистическая оценка проводилась нетренированной и некурящей группой из 20 испытуемых (10 мужчин и 10 женщин, возраст от 19 до 65 лет), просили описать вкус, запах и текстуру сыра.

Приготовление водного экстракта и без-белкового экстракта . Образцы сыра (1 г) гомогенизировали в 10 мл дистиллированной воды, суспензию оставляли на 1 ч при 4 ºС, затем фильтровали через бумажный фильтр и использовали для анализа как водный экстракт (ВЭ). Для получения безбелкового экстракта (ББЭ) в 5 мл водного экстракта добавляли 0,2 мл 90 % трихлоруксусной кислоты, выдерживали 5 мин, потом центрифугировали 8000 об/мин 10 мин при комнатной температуре, супернатант собирали и использовали для анализа.

Суммарные фенольные соединения (СФС) в водном экстракте (ВЭ) и ББЭ определяли с помощью реактива Фолина-Чиокальтеу. Для этого 250 мкл образца добавляли к 250 мкл реагента Фолина-Киокальтеу, через 10 мин добавляли 1,25 мл раствора карбоната натрия (5 %) и 0,75 мл чистой воды и перемешивали. Затем смесь инкубировали в течение 1 ч в темноте и измеряли абсорбцию при 750 нм с помощью спектрофотометра (СФ-2000, Россия). Результаты выражали в тирозиновых эквивалентах, мкг/мл.

Анализ концентрации пептидов осуществляли с помощью O-фтальдиальдегидного анализа (OPA): ББЭ (100 мкл) смешивали с 1,0 мл раствора реагента OPA (ThermoScientific, США) и инкубировали в течение 2 мин. Абсорбцию из- меряли при 340 нм (спектрофотометр СФ-2000, Россия).

Оценка радикал-связывающей активности . Для анализа 1 мл образца (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 1 мл свежеприготовленного 0,12 мМ раствора 2,2-ди-фенил-1-пикрилгидразила (ДППГ) в этаноле. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Смеси центрифугировали в течение 2 минут при 10000 об/мин. Поглощение супернатанта измеряли при 517 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия). Активность поглощения радикалов рассчитывали по следующему уравнению:

Ингибирование, % = [(абсорбция контроля – абсорбция образца)/(абсорбция контроля)] · 100 %.

Оценка гидроксил-радикал-связывающей активности . Для анализа 0,5 мл образца (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 0,5 мл дистиллированной воды, затем приливали 1 мл образца, добавляли 1 мл 5 мМ/л раствора сульфата железа (FeSO 4 ), 1 мл 5 мМ/л раствора салициловой кислоты в этаноле, 1 мл 0,03 % раствора перекиси водорода, затем перемешивали и инкубировали при 37 °C в течение 30 мин, центрифугировали 5 мин при 9000 об/мин и отбирали надосадочную жидкость. Поглощение супернатанта измеряли при 510 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия). Активность поглощения радикалов рассчитывали по следующему уравнению:

Ингибирование, % = [(абсорбция контроля – абсорбция образца)/(абсорбция контроля)] · 100 %.

Определение восстанавливающей активности . 1 мл исследуемых образцов (водный экстракт или безбелковый экстракт) смешивали с 1 мл 0,2 М K-Na фосфатного буфера (рН 6,5) и 1 мл 1 % феррицианида калия. Реакционную смесь инкубировали 20 мин при 50 °С, охлаждали, после чего добавляли 1 мл 10 % трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугировали при 7000 г 5 мин при комнатной температуре. К супернатанту (1 мл) добавляли 1 мл дистиллированной воды и 200 мкл 0,1 % FeCl 3 . Абсорбцию реакционной смеси измеряли при 700 нм с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия).

Анализ текстуры проводился в соответствии с [16], с некоторыми изменениями. Сыр нарезали кубиками размерами 1 × 1 × 1 см. Текстурный профиль определяли при температуре (25 ± 1) °C с помощью текстурометра «Структурометр СТ-2» и программного обеспечения ST-Data-TPA (ООО

«Лаборатория качества», Россия). Испытание проводили с помощью цилиндрического зонда диаметром 36 мм, который внедрялся в исследуемые образцы. Было произведено 2 цикла погружения зонда со скоростью 0,5 мм/с. Образцы сжимали на 50 % от первоначальной высоты.

В ходе анализа были измерены твердость (пиковая сила, возникающая при первом сжатии), упругость (отношение расстояния, на которое поднимается поршень при втором сжатии, к исходному расстоянию сжатия), когезия (отношение площадей второго и первого сжатий) и пережевываемость (произведение твердости, упругости и когезии).

Результаты и их обсуждение. В работе изучали влияние незаквасочного штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L в составе сырной закваски на комплекс показателей, в том числе отражающих активность штамма в условиях молочного сырья в технологии полутвердого сыра. Выявлено, что уже на стадии ферментации молока добавление L. plantarum FCa3L приводит к более интенсивному накоплению молочной кислоты, на протяжении 2 ч ферментации показатель рН в варианте +FCa3L был на 0,2 ед. меньше, чем в контроле (рис. 1). В процессе созревания эта тенденция сохранилась, в течение 45 дней рН в экспериментальном варианте был ниже.

Рис. 1. Изменения рН молока в процессе ферментации (А) и динамика рН сыра в процессе созревания (Б)

Changes in milk pH during fermentation (A) and cheese pH dynamics during ripening (Б)

Анализ химических показателей выявил более активное накопление молочной кислоты в образце +FCa3L в процессе созревания, что свидетельствует об отсутствии ингибирования кислотообразования всей закваски в присутствии L. plantarum FCa3L (табл. 2). Влажность сыров при закладке на созревание различалась, в варианте с L. plantarum FCa3L она была выше на 2 %. Через 14 сут, как и следовало ожидать, более значимое, чем в контроле. На всем протяжении созревания контрольный сыр постепенно отдавал воду, чего не скажешь о варианте +FCa3L. Изменение количества жира было обратно пропорционально количеству влаги, что ожидаемо. Общее содержание белка при созревании в обоих случаях практически не изменялось. Надо заметить, что вариант +FCa3L лучше просолился, о чем свидетельствует большая количество влаги резко уменьшилось, причем в концентрация соли в сыре.

варианте с L. plantarum FCa3L это уменьшение

Химические показатели сыров в процессе созревания The chemical parameters of cheeses during the ripening process

Таблица 2

Вариант сыра	Срок созревания, сут	Молочная кислота, %	Белок, %	Жир, %	Влажность, %	Соль, %	Глюкоза, мкМ/л
1	2	3	4	5	6	7	8
Контроль	3	8,235	26,085	31,86	39,989	2,466	12,25
	10	8,145	26,173	35,945	35,915	1,967	12,75
	30	8,875	25,670	39,160	33,089	2,081	13,50
	45	8,740	26,378	39,876	31,609	2,137	13,59

Окончание табл. 2

1	2	3	4	5	6	7	8
+FCA3L	3	8,505	26,422	29,173	41,727	2,678	13,63
	10	8,730	25,857	38,624	33,015	2,504	13,75
	30	8,910	26,323	39,866	31,531	2,280	14,00
	45	9,270	26,467	39,682	30,975	2,876	13,75

Анализ пептидов, как показателей протеолитической активности, показал, что добавление в закваску штамма FCa3L увеличивает гидролиз белков под действием бактериального консорциума с образованием низкомолекулярных продуктов (рис. 2, А). Особенно активное накопление пептидов было в период первых 14 сут, в дальнейшем в варианте сыра с FCa3L наблюдалось снижение этого показателя. Такой ход кривой свидетельствует об активных микробных процессах включения продуктов гидролиза белков в метаболические пути. Что касается контроля, то здесь наблюдалось накопление пептидов через 14 сут, с дальнейшей стабилизацией этого показателя. Минимальное изменение количества пептидов в процессе созревания, видимо, является следствием снижения численности заквасочных бактерий.

0.4

A

3 0.3 м о

I 0.2

S I-с о с 0.1

10     20     30     40     50

Время созревания, сут

0.0

-•- Ко н т р ол ь _ ББ Э "▼“ +FCa3 L _ ББ Э

-•- Контроль_ВЭ

-■- +FCa3L_ВЭ

-•- К о н т р ол ь _ ББ Э

^- + F Ca 3 L _Б БЭ

Время созревания, сут

Рис. 2. Изменения количества пептидов в безбелковом экстракте (ББЭ) (А) и количества фенолсодержащих соединений в водном экстракте (ВЭ) и ББЭ (Б) в процессе созревания сыра Changes in the level of peptides in protein-free extract (PFE) (A) and the level of phenolic compounds in water extract (WE) and PFE (Б) during cheese ripening process

Добавление в состав закваски пробиотического штамма FCa3L приводило к увеличению суммарного количества фенольных соединений в водном и безбелковом экстракте (рис. 2, Б), этот показатель служит индикатором присутствия соединений с ароматической группой, обладающих антиоксидантными свойствами.

В процессе созревания были выявлены отличия структурно-механических свойств между образцами. Прежде всего сырное зерно, формируемое при созревании, в варианте с FCa3L отличалось большей влагоудерживающей способностью (рис. 3, А). Кроме того, сырное зерно в варианте +FCa3L было способно больше сорбировать добавленную воду (рис. 3, Б). Таким образом, добавление в закваску пробиотического штамма позволяет формировать одновре- менно сырную матрицу с повышенной сочностью за счет остаточной воды и способности вбирать дополнительно влагу извне.

Текстурные характеристики образцов сыра значимо отличались (рис. 4), эти отличия формировались по мере созревания сыров. Показатель твердости резко вырос на 14-е сут созревания как в контрольном, так и в опытном образце. В процессе дальнейшего созревания, к 28-м сут, твердость обоих образцов понизилась, а на 42-е сут созревания этот показатель опять увеличился как в контрольном, так и в опытном образце. Следует отметить, что на 3-и сут созревания твердость была выше у контрольного образца, а начиная с 14-х сут созревания твердость была выше у опытного образца.

Рис. 3. Изменения влагоудерживающей (А) и влагосвязывающей (Б) способности сыра в процессе созревания

Changes in water-holding (A) and water-binding (Б) capacity during cheese ripening process

Похожая картина наблюдалась при анализе показателя пережевываемости. Пережевывае-мость опытного образца на 3-и сут была существенно ниже контрольного, однако на 14-е и 28-е сут созревания разница в этом показателе уже не была столь значительной, а на 42-е сут пережевываемость опытного образца стала выше, чем у контрольного.

Показатели упругости и когезии постепенно снижались в течение всего срока созревания, причем значения этих показателей у опытного образца были ниже по сравнению с контрольным. Следует отметить, что в контрольном образце снижение значений как упругости, так и когезии происходило более интенсивно.

Рис. 4. Изменения показателей текстурного профиля сыров в процессе созревания : А – твердость; Б – упругость, В – когезия; Г – пережевываемость Changes in the textural profile of cheeses in the process of ripening: A – hardness; Б – elasticity, В – cohesion, Г – chewiness

Органолептическая характеристика сыров была различна, корка у обоих образцов была прочная, ровная, без повреждений. Консистенция различалась: если у контроля тело сыра было умеренно эластичным, то в варианте с FCa3L оно было более плотным. На разрезе у обоих образцов были глазки неправильной формы, в контроле они располагались равномерно по всей толще, а в варианте с FCa3L менее равномерно. Вкус сыра в варианте с FCa3L был более острый, насыщенно сырный, тогда как в контроле выраженный сырный вкус чуть кисловатый. Цвет образцов различался, сыр с пробиотиком был более темный, что подтверждается и инструментальным анализом (рис. 5), показатель L (белизны) меньше в сыре FCa3L, кроме того, показатель a в варианте FCa3L более стабилен при созревании и не стремится к 0. Показатель b не подвержен флуктуациям при созревании, формируется устойчивая желтая окраска, тогда как в контроле интенсивность желтизны больше к концу созревания.

A

Б

о Контроль

-3

Время созревания, сут

Время созревания, сут

Время созревания, сут

Рис. 5. Изменения цветовых характеристик сыра в процессе созревания: A – L показатель белизны (+)белый/(–)черный; Б – (+)краснота/(–)зеленость;

В – (+)желтизна/(–)голубизна

Changes in color characteristics of cheese during ripening:

A – L indicator of whiteness (+)white/(–)black; Б – (+) redness/(–)greenness;

В – (+)yellowness/(–)blueness

Антиоксидантные свойства кисломолочных напитков обеспечиваются различными продуктами метаболизма: аминокислотами, биоактивными пептидами, которые высвобождаются из α-лактальбумина, β-лактоглобулина и α-казеина в процессе ферментации, вновь синтезированными пептидами [17, 18]. Учитывая процессы молочнокислого брожения, протеолиза, протекающих в сыре, можно предположить, что сыр содержит в своем составе компоненты с антиоксидантными свойствами. В исследовании проводили анализ безбелкового экстракта и водного экстракта сыра (рис. 6), такое разделение дало возможность оценить отдельно вклад низкомолекулярных пептидов. Радикалсвязываю-щая активность низкомолекулярных соединений в ББЭ на протяжении почти всего процесса созревания была выше в варианте с FCa3L. При этом этот показатель не отличался при анализе водного экстракта, что, видимо, обусловлено большим вкладом в реализацию связывания радикалов экстрагируемых молочных белков.

Гидроксил-радикалсвязывающая активность компонентов ББЭ в варианте сыра FCa3L была на всем протяжении созревания выше, тогда как в водном экстракте выявлены значительные флуктуации. Возможно, за реализацию способности связывать гидроксил-ионы отвечают группы веществ в сырном матриксе, претерпевающие преобразования под действием молочнокислых бактерий. Восстановительная сила ББЭ и водного экстракта как контрольного, так и опытного варианта сыров не отличалась на всем протяжении созревания.

Активное использование пробиотиков в технологии кисломолочных напитков является катализатором расширения ассортимента продуктов, в технологии которых могут быть использованы пробиотические бактерии. В настоящей работе была продемонстрирована возможность использования штамма L. plantarum FCa3L [19] с целым рядом пробиотических свойств в технологии полутвердого сыра. Штамм L. plantarum FCa3L не влияет на общее содержание основных пищевых веществ в сыре. Однако выявле- ны изменения накопления продуктов протеолиза в варианте сыра с добавлением L. plantarum FCa3L. В ранний период созревания наблюдается усиленное накопление низкомолекулярных пептидов в сыре FCa3L. Аналогичные результаты были получены исследователями при использовании Lactobacillus helveticus в чеддере [20]. Кроме того, выявлено повышенное накопление фенолсодержащих соединений как продуктов гидролиза молочных белков, так и про- дуктов метаболизма МКБ в экспериментальном варианте. Роль пептидов, продуктов метаболизма МКБ в формировании полезных свойств кисломолочных продуктов обсуждается во многих работах [20, 21]. В наших исследованиях выявлен больший антиоксидантный потенциал в варианте с L. plantarum FCa3L, что коррелирует с большей интенсивностью накопления продуктов протеолиза.

Б о" 30

о 20

Время созревания, сут

30    40

Контроль +FCa3L

Рис. 6. Изменения антиоксидантных свойств сыров в процессе созревания :

• А, Б – радикалсвязывающая активность; В, Г – гидроксил-радикал-связывающая активность; Д, Е – восстанавливающая активность; А, В, Д – безбелковый экстракт,

Б, Г, Е – водный экстракт

Changes in antioxidant properties of cheese in the ripening process:

• A, Б – radical-scavenging activity; В, Г – hydroxyl-radical-scavenging activity;

Д, Е – reducing activity; A, В, Д- protein-free extract; Б, Г, Е – water extract

Интересным является факт изменения текстуры сыра, если в состав закваски интродуцирован L. plantarum FCa3L. Показатель твердости указывает на требуемое усилие для деформации твердого тела. Применительно к сырам этот показатель связан с влажностью продукта. Влага в сыре служит своеобразным связующим звеном, обеспечивая молекулам возможность свободного перемещения относительно друг друга, и способствует мягкости и пластичности продукта [22]. Высокие значения влажности в начальный период созревания обуславливают низкие значения твердости, и наоборот, по мере снижения влажности при дальнейшем созревании твердость сыров увеличивалась. Снижение когезии и упругости в процессе созревания может быть связано с протеолизом белковых молекул, а также с накоплением молочной кислоты. По мере увеличения протеолиза или сниже- ния рН целостность и сцепление мицелл казеина в сыре нарушаются [23]. Кроме того, имеются сведения, что по мере ослабления связей внутри белковой матрицы увеличивается взаимодействие белков с влагой [24]. Это в свою очередь приводит к ослаблению структурных связей между частицами сыра и снижению когезии.

Принимая во внимание полученные в процессе комплексного исследования результаты, можно говорить о положительной роли пробиотического штамма L. plantarum FCa3L в составе закваски для полутвердых сыров. Высокие технологические параметры полученного сыра в совокупности с показанными ранее высокими антагонистическими свойствами L. plantarum FCa3L по отношению к патогенным бактериям делает перспективным применение этого штамма в сыроделии

Заключение. Проведенное исследование продемонстрировало, что добавление пробиотического штамма Lactiplantibacillus plantarum FCa3L в закваску для полутвердого сыра оказывает значительное влияние на его качественные и функциональные характеристики. Было установлено, что штамм FCa3L способствует более интенсивному кислотообразованию, что подтверждается снижением pH на всех этапах созревания. Кроме того, наблюдалось увеличение протеолитической активности, что привело к накоплению низкомолекулярных пептидов и фенольных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Текстурные свойства сыра также изменились: образец с FCa3L показал более высокую твердость и пережевывае-мость, что связано с улучшенной влагоудержи- вающей способностью сырной матрицы. Органолептическая оценка выявила более насыщенный вкус и устойчивый цвет у сыра с пробиотиком. Антиоксидантная активность, особенно в безбелковом экстракте, была выше в варианте с FCa3L, что подтверждает его потенциал в улучшении функциональных свойств продукта. Таким образом, использование штамма L. plantarum FCa3L в технологии полутвердого сыра не только сохраняет традиционные показатели качества, но и обогащает его пищевую ценность за счет увеличения содержания биоактивных компонентов. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшего изучения пробиотических штаммов в сыроделии и разработки новых функциональных продуктов.