Исследование возможности развития спор Clostridium botulinum во фруктовых консервах из персиков, абрикосов и груш

Введение. Одной из важнейших отраслей пищевой промышленности является производство фруктовых консервов для детского питания. Персики, абрикосы и груши широко используются при производстве пюреобразных консервов для детского питания.

Пюре из персиков, абрикосов и груш имеет, как правило, рН в пределах 3,6–4,5. В рецептуру консервов обычно добавляют лимонную кислоту для доведения рН консервов ниже величины 3,8 и пастеризуют при температуре ниже 100 °С в условиях, обеспечивающих гибель нетермостойкой микрофлоры. Но, в соответствии с ТР ТС 023/2011 на соковую продукцию [1], количество добавляемой лимонной кислоты не должно превышать 3 г/кг продукта. Поэтому часто величина рН продукта из персиков, абрикосов и груш превышает 3,8, и его приходится стерилизовать при температуре 110 °С. Стерилизация кислых продуктов при повышенной температуре может сопровождаться химическим разложением сахаров, что приводит к накоплению в продукте 5-оксиметилфурфурола, который обладает ограниченным токсическим действием и содержание которого нормируется в продуктах для детского питания [1].

В Российской Федерации консервы, в зависимости от активной кислотности (рН) продукта, делятся на группы А, Б, В и Г [2, 3]. Деление консервов на эти группы связано с возможностью развития в них C. botulinum . В Российской Федерации считается, что в консервах групп А и Б с рН более 4,2 и неконцентрированных томатопродуктах развитие C. botulinum возможно, в концентрированных томатопродуктах и консервах группы В с рН 3,7–4,2 – маловероятно, в консервах группы Г с рН менее 3,7 – невозможно [4, 5].

В работах [6] и [7] была показана возможность развития и токсинообразования C. botulinum в консервах из абрикосов с рН ниже 4,2. Вся нормативная документация по контролю производства фруктовых консервов из абрикосов, персиков и груш, в части определения соответствия консервов требованиям промышленной стерильности, основана на том, что данные виды консервов, как исключение, включены в группу А [3]. Поэтому при выработке консервов с рН выше 3,8 их стерилизуют при температуре порядка 110 °С в течение времени, обеспечивающего гибель спор С. botulinum .

Результаты исследований, приведённые в работах [6] и [7], на наш взгляд, не бесспорны, к их выводам есть ряд замечаний. Например, в работе [6] приведены экспериментальные данные об образовании ботулинического токсина типа В в образце консервов «Пюре из абрикосов» с рН продукта 3,6.

При этом авторами отмечено, что в продукте обнаружены «нити». Можно предположить, что «нитями» являлись гифы плесневых грибов. В то же время, как отмечено в Кодексе Алиментариус, известны случаи, когда неправильно обработанные баночные консервы способствовали развитию плесени и других микроорганизмов, что увеличивало рН продукта выше 4,6 и вызывало развитие C. botulinum в этих продуктах [8].

Цель исследования. Разработка научно обоснованных режимов стерилизации и пастеризации фруктовой консервированной продукции из абрикосов, персиков и груш, обеспечивающих ее качество и безопасность.

Задачи исследования : проведение на современном уровне репрезентативного комплекса экспериментов для изучения возможности развития C. botulinum в однокомпонентных консервах из абрикосов, персиков и груш с рН ниже 4,5. Доказательство отсутствия развития C. botulinum в данных консервах могло бы стать базой для отнесения их к группе Г (вместо группы А). Консервы из фруктового сырья имеют гарантированный срок годности 1–2 года. Исходя из этого, актуальным является исследование возможности развития C. botulinum в течение данного срока годности этих консервов.

Материалы и методы исследования. Исследования проводили с использованием музейных культур микроорганизмов, имеющихся в лаборатории качества и безопасности пищевой продукции ВНИИТеК. В работе использовали споры C. botulinum типа В (штамм В-364). Этот тип является наиболее частым возбудителем пищевых отравлений ботулинической этиологии от плодоовощных консервов. Вторым штаммом был взят C. botulinum типа А (штамм А-98) как наиболее кислотоустойчивый тип [5].

Иногда ботулинический токсин синтезируется внутри вегетативной клетки в форме неактивного предшественника – протоксина, который превращается в токсин во внешней среде под действием собственной протеазы или в результате обработки раствора протеолитическими ферментами, на- 131

пример трипсином. Поэтому, в соответствии с ГОСТом [9], в конце сроков хранения консервов проводили и определение наличия протоксина.

Споровые суспензии C. botulinum для заражения консервов получали в соответствии с «Положением о разработке режимов стерилизации и пастеризации консервов…» [10] на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат казеина «Soyabean Casein Digest Medium – Tryptone Soya Broth» («HiMedia», Индия). На этой среде были получены суспензии, содержащие не менее 70 % спор.

Количество образовавшихся спор контролировали микроскопированием. Споры отделяли от культуральной среды центрифугированием при 275 g в течение 30 мин.

Отмытые от культуральной среды споры и клетки суспензировали в 0,1 М растворе фосфатного буфера с рН 6,98. Для инактивации оставшихся вегетативных клеток полученные споровые суспензии прогревали при 80 оС в течение 20 мин. Титр полученных споровых суспензий определяли методом десятикратных разведений с последующим посевом по 1 см3 каждого из приготовленных разведений на плотную питательную среду в трубки Вейона, с последующим прямым подсчетом числа выросших колоний. С целью повышения статистической надежности результатов подсчета посев проводили в две параллельные трубки Вейона на одно разведение. Полученные суспензии содержали не менее 1,0×107 спор в 1 см3.

Подсчет количества выросших колоний проводили способом прямого учета их числа по ГОСТ ISO 7218-2015 [11]. При этом рассчитывали число спор, присутствующих в пробе, как средневзвешенное значение из двух подсчетов последовательных разведений по формуле

N=∑C/(V×1,1×d), где N – количество спор; ∑C – сумма колоний, подсчитанных в двух паралельных трубках Вейо-на, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений; V – объем посевного материала, внесенного в каждую трубку Вейона, см3; d – коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению (в случае отсутствия разведения d =1). Результат вычисления округляли до двух значащих цифр.

Количество выживших в продукте спор также определяли методом разведений. Если при высе- ве разведений продукта на твердой питательной среде в трубках Вейона не содержалось колоний, то, в соответствии с ГОСТом [11], результат учитывали как «менее 1/(V×d)» микроорганизмов, где V – объем инокулята (1 см3), а d – соответствующее разведение продукта.

Образцы фруктовых консервов для заражения спорами готовили в соответствии с Технологической инструкцией (ТИ) по производству фруктовых пюреобразных консервов для детского питания [12]. Образцы консервов «Нектар из персиков» вырабатывали по ГОСТ 52187-2009 «Консервы. Нектары фруктовые» [13].

Из литературы известно о существовании факторов, понижающих чувствительность развития C. botulinum к ингибирующему влиянию рН среды. Одним из таких факторов являются продукты белкового распада [4]. Для определения возможности развития спор и токсинообразования C. botulinum в консервах из груш и абрикосов было проверено пюре с белковыми молочными добавками (сливками). Консервы «Грушевое пюре со сливками» и «Грушево-абрикосовое пюре со сливками» вырабатывали в соответствии с ТИ «Пюре из плодов и ягод со сливками «Неженка» [12].

Для доведения рН продукта до требуемой величины в консервах использовался способ прямого подкисления или подщелачивания приготовленных пюре. При этом непосредственно в пюре при перемешивании добавляли растворы гидроокиси натрия концентрацией 100 г∕дм3 или лимонной кислоты концентрацией 200 г∕дм3 [14].

Полученный продукт расфасовывали в стеклянные бутылки вместимостью 250 см3 с крышками «Твист-Офф» винтового типа. Бутылки укупоривали вручную, затем стерилизовали в водяном автоклаве в соответствии с ТИ. Предварительно, перед укупоркой бутылок, для исключения избыточного растворения воздуха пюре прогревали на водяной бане до температуры фасовки 60 °С.

В простерилизованные образцы консервов вносили, открывая бутылки с соблюдением правил асептики, смесь спор C. botulinum типов А и В, в равном соотношении, в количестве около 1,0×10⁴ спор на 1см³ продукта. Перед внесением спор, для исключения избыточного растворения воздуха и сохранения анаэробных условий, консервы прогревали в термостате при температуре 60 ^оС около 60 мин.

Заражённые смесью спор С. botulinum типов А и В консервированные продукты хранили в оптимальных для развития С. botulinum условиях – при температуре 30±1 ^оС. После заражения через каждые 3 месяца хранения консервов проводили определение количества выживших спор в продукте, через каждые 6 месяцев контролировали наличие ботулинического токсина путем постановки биопробы на белых мышах. По завершении 24 месяцев хранения в консервах дополнительно проверяли наличие ботулинического протоксина по ГОСТ 10444.7-86 [9].

Определение величины рН проводили непосредственно в продукте потенциометрическим методом с использованием рН метра «HANNA pH 211» (Румыния). При определении рН продукта пользовались комбинированным стеклянным электродом. При эксплуатации прибора, перед определением рН, прибор и электроды стандартизировали с помощью буферов с рН 4,01 и 6,98 при температуре окружающего воздуха 20–25 °С. Суммарная погрешность определения рН этим прибором не более ±0,05 рН в диапазоне 2–9 рН, при температурах измеряемых образцов и окружающей среды 15–40 °С [15].

Результаты исследования и их обсуждение. Интегральный анализ результатов исследований показал отсутствие развития спор С. botulinum во фруктовых консервах из персиков, абрикосов и груш с рН ниже 4,5 в течение всего периода хранения. Экспериментальные данные, полученные в результате трехлетних исследований, представлены в таблицах 1 и 2.

Количество спор C. botulinum типов А и В при различных значениях рН фруктовых консервов в зависимости от сроков хранения в 1 г продукта

Таблица 1

Консервы	Исходные		3 мес.	6 мес.	9 мес.	12 мес.	15 мес.	18 мес.	21 мес.	24 мес.
	Кол-во спор	рН	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Наличие токсина и протоксина
Абрикосовое пюре	6,4.×104	3,86	2,8×104	1,3×104	3,8× 103	1,1× 103	5,9× 101	5,5×101	Менее 10	Менее 10	Не обнаружено
	6,2× 104	3,91	3,9× 104	1,7× 104	4,2× 103	1,4× 103	1,1× 102	6,4×101	Менее 10	Менее 10	Не обнаружено
	6,8× 104	3,99	4,9× 104	2,2× 104	6,7× 103	4,8× 103	4,0× 102	1,6×102	5,0×101	Менее 10	Не обнаружено
	6,1× 104	4,11	4,3× 104	1,8× 104	7,7× 103	7,4× 103	2,7× 103	2,5×102	2,1×101	Менее 10	Не обнаружено
	6,8× 104	4,30	6,0× 104	3,1× 104	1,6× 104	1,5× 104	5,7× 103	1,1× 103	2,4× 102	2,8× 101	Не обнаружено
	4,7× 104	4,49	4,1× 104	2,5× 104	1,8× 104	1,6× 104	1,0× 104	1,4× 103	2,6× 102	1,3× 102	Не обнаружено
Грушевое пюре	3,2× 104	3,80	1,5× 104	1,3× 104	6,8× 103	2,2× 103	2,6× 101	1,8× 101	Менее 10	Менее 10	Не обнаружено
	2,6× 104	4,20	2,2× 104	2,1× 104	8,5× 103	4,4× 103	3,7× 103	3,0× 103	5,9× 102	6,3× 101	Не обнаружено
Персиковый нектар	7,2× 104	3,83	5,9× 104	5,1× 104	2,3× 104	3,6× 103	1,9× 103	8,2× 102	1,8× 102	Менее 10	Не обнаружено
	7,4× 104	4,00	6,8× 104	3,6× 104	2,2× 104	1,3× 104	7,3× 103	4,6× 103	1,7× 103	Менее 10	Не обнаружено
	7,3× 104	4,31	7,1× 104	5,6× 104	2,9× 104	8,1× 103	6,4× 103	5,8× 103	1,8× 103	4,2× 101	Не обнаружено
	2,8× 104	4,41	2,6× 104	1,5× 104	1,1× 104	6,8× 103	3,1× 103	4,0× 102	3,5× 102	3,0× 101	Не обнаружено

HbllCvH этГ^ээнпнУэдб

Таблица 2

Консервы	Исходные		3 мес.	6 мес	9 мес.	12 мес	15 мес.	18 мес.	21 мес.	24 мес.
	Кол-во спор	рН продук-та	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Кол-во спор	Наличие токсина и протоксина
Грушевое пюре со	5,1× 104	4,22	4,0× 104	2,7× 104	1,3× 104	1,0× 104	6,1× 103	4,6× 103	5,4× 101	Менее 10	Не обнаружено
сливками	5,5× 104	4,42	5,0× 104	4,6× 104	4,3× 104	1,4× 104	8,1× 103	3,9× 103	1,7× 102	3,6× 101	Не обнаружено
Грушево-абрикосовое пюре со сливками	1,0× 104	3,84	8,3× 103	4,5× 103	5,3× 102	3,6× 102	9,1× 101	5,4× 101	Менее 10	Менее 10	Не обнаружено
	1,0× 104	4,15	9,4× 103	8,5× 103	5,2× 103	4,8× 103	3,5× 103	4,9× 102	6,5×. 101	2,1× 101	Не обнаружено
	1,3× 104	4,41	1,1× 104	9,5× 103	6,8× 103	5,9× 103	4,6× 103	7,8×. 102	2,6× 102	8,8× 101	Не обнаружено

Количество спор C. botulinum типов А и В при различных значениях рН фруктовых консервов с молочными добавками в зависимости от сроков хранения в 1 г продукта

Вестник КрасГАУ. 2018. № 2

В таблицах представлены варианты консервов из абрикосов, персиков и груш, начальные значения рН продукта и количество выживших спор после указанных сроков хранения.

В процессе хранения консервов происходило отмирание спор C. botulinum . В первые месяцы хранения отмечено небольшое снижение количества спор С. botulinum , внесённых в продукт при заражении. Начиная с 15-го месяца хранения, имело место значительное уменьшение данного показателя. При этом при более низких значениях рН продукта процесс отмирания спор происходил быстрее. При рН продукта ниже 4,0, после 24 месяцев хранения консервов споры не обнаруживали в 0,1 г продукта, то есть в первом разведении продукта. При рН более 4,0 споры выживали в продукте и после 24 месяцев хранения. Проводили заражение консервов в количестве около 1,0 х 10⁴ спор на грамм продукта, а выживали десятки спор.

Наличие токсина в проанализированных образцах консервов ни в одном случае обнаружено не было. В этих консервах после 24 месяцев хранения не обнаружено и ботулинических протоксинов.

Выводы . Проведенная работа позволяет предложить изменить в Российской Федерации подходы к делению фруктовых консервов на группы и, соответственно, к разработке режимов стерилизации (пастеризации) консервов из абрикосов, персиков и груш. Если раньше для этих видов консервов с рН выше 3,8 режимы стерилизации должны были обеспечить гибель спор С. botulinum , то полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать в качестве тест-микроорганизмов при разработке режимов стерилизации (пастеризации) менее термоустойчивые споры плесневых грибов Aspergillus fischeri или Byssochlamys nivea.

Снижение режимов тепловой обработки приведёт к улучшению органолептических показателей консервов из абрикосов, персиков и груш и уменьшению затрат на их производство.