Исследование возможности снятия отравлений тяжелыми металлами наночастицами селена

Известно, что наночастицы селена могут использоваться для активации антиоксидантной системы [1, 2, 3] и регенерации тканей [4, 5, 6], так же они находят применение при онкологических заболеваниях [7, 8], и патологии щитовидной железы [9].

Тяжелые металлы, которые попадают в организм животных и человека, влияют на различные физиологические функции, повышая количество свободно радикальных реакций, что в дальнейшем приводит к увеличению окислительного стресса в клетках, разрушая клеточные мембраны. Доказано влияние тяжелых металлов и на ферменты, белки, РНК и ДНК, что приводит к широкому спектру нарушений в организме [10].

Кобальт, является незаменимым микроэлементом, однако завышенное потребление кобальта приводит к ряду заболеваний, в частности анемии, неврологическим, сердечно-сосудистым и эндокринным дисфункциям, а также нарушению слуховых и зрительных анализаторов [11].

Соли кадмия обладают токсическим эффектом с накопительными последствиями и представляют особую опасность для мочевыделительной системы, в частности к почечной недостаточности [12].

Ртуть и ее соли представляют особую опасность, связанную с накопительным эффектом и широким распространением данного металла при производстве в качестве побочного продукта, негативное воздействие ртути на организм животных и человека широк и может приводить к самым негативным воздействиям во всем спектре жизнедеятельности [13, 14, 15].

Цель работы: разработать метод синтеза наночастиц селена из селеноорганических соединений, стабилизированных разрешенных в фармацевтической практике поверхностно активным веществом ТВИН-80 и исследовать возможность их применения для снятия отравления тяжелыми металлами на примере сульфата кадмия, нитрата ртути и хлорида кобальта.

Условия, материалы и методы. Исследования проводились на базе ЦКП «Молекулярная биология» и кафедры «Микробиология и биотехнология» ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова». Для синтеза наночастиц селена (nSe) использовался дихлордиацетофенонилселенид, который получали в одну стадию из ацетофенона, селенистой кислоты в условиях кислотного катализа. Для синтеза 1 моля дихлордиацетофенонилсе-ленида при постоянном перемешивании в плоскодонную колбу, снабженную мешалкой и температуре 20^ к 2,4 моль ацетофенона растворенного в этиловом эфире уксусной кислоты, добавляли 1,1 моль селенистой кислоты, растворенной в воде и 3 моля хлороводорода в виде концентрированной соляной кислоты, через 120 минут полученный осадок отфильтровывали, далее промывали водой и ацетоном. Затем полученный дихлордиацето-фенонилселенид растворяли в изопропиловом спирте и добавляли при постоянном перемешивании ТВИН-80, растворенный в воде при соотношении 9:1. В полученный раствор добавляли избыток аммиака и перемешивали на протяжении 5 часов, полученный раствор упаривали на роторном испарителе и получали наночастицы селена с содержанием селена 10%.

Размер частиц определяли методом динамического рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS.

Для проведения токсичности были использованы белые мыши линии BALB/c, испытания проводили в соответствии с ГОСТ 326442014.

В модельных исследованиях на снятие отравления тяжёлыми металлами было создано 8 групп животных по 10 мышей в каждой.

Животным первой группы перорально вводили 0,89% раствор натрия хлорида в количестве 100 мкл в день на протяжении 7 дней, на 7 сутки через 2 часа после введения производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием внутренних органов (табл. 1, 2). Животным второй группы перорально вводили раствор наночастиц селена стабилизированных ТВИН-80 из расчета 1 мг/кг наночастиц селена в объеме 100 мкл в день на протяжении 7 дней, на 7 сутки через 2 часа после введения производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным третьей группы перорально вводили раствор хлорида кобальта (CoCl2) в объеме 100 мкл, с дозой 200 мг/кг в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным четвертой группы перорально вводили нитрат ртути (Hg(NO3)2) в количестве 100 мкл, с дозой 140 мг/кг. Вещества вводили в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным пятой группы перорально вводили сульфат кадмия (CdSO4) в количестве 100 мкл, с дозой 200 мг/кг, в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным шестой группы вводили наночастицы селена стабилизированные ТВИН-80 из расчета 1 мг/кг наночастиц селена в количестве 100 мкл, а через 1 час вводили CoCl2 (200 мг/кг), в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным седьмой группы вводили наночастицы селена стабилизированные ТВИН-80 из расчета 1 мг/кг наночастиц селена в количестве 100 мкл, а через 1 час вводили Hg(NO3)2 (140 мг/кг), в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов (табл. 1, 2). Животным восьмой группы вводили наночастицы селена стабилизированные ТВИН-80 из расчета 1 мг/кг наночастиц селена в количестве 100 мкл, а через 1 час вводили сульфат кадмия (CdSO4) в количестве 100 мкл, с дозой 200 мг/кг, в течение 7 суток, на 7 сутки через 2 часа после введения токсиканта производили транслокацию шейных позвонков с дальнейшим отбором крови и исследованием органов.

Результаты и обсуждение. В результате проведенного синтеза наночастиц были получены частицы размером 15-32 нм стабилизированные ТВИН-80, что было установлено методом динамического рассеяния света (табл. 1, рис. 1), при исследовании на острую токсичность в соответствии с ГОСТ 326442014 было установлено LD 50 =200 мг/кг, что позволяет отнести наночастицы селена к 3 классу опасности.

Таблица 1 - Данные динамического рассеяния света наночастиц селена

Size d. nm	Mean Volume %
3,122	3,6
3,615	12,6
4,187	19,0
4,849	18,1

Size d. nm	Mean Volume %
5,615	14,1
6,503	10,3
7,531	7,7
8,721	5,7

Size d. nm	Mean Volume %
10,10	3,9
11,70	2,4
13,54	1,2
15,69	0,5
18,17	0,1

Size d. nm	Mean Volume %
58,77	0,1
68,06	0,1
78,82	0,1
91,28	0,1

Statistics Graph (1 measurements)

Рисунок 1 - Данные динамического рассеяния света наночастиц селена

В рамках испытания на модельных животных и по результатам вскрытия было установлено, что у животных 1, 2, 6, 7, 8 групп, отсутствие визуальных отклонений органов от нормы.

При этом установлено достоверное повышение трансаминаз в сыворотке крови мышей второй опытной группы АЛТ на 98% и АСТ на 38%, относительно интактных животных, которым в течение 7 дней вводили раствор наночастиц селена (табл. 2). При этом нарушений функциональной активности гепатобилиарной и мочевыделительной систем выявлено не было. Это подтверждается результатами вскрытия животных, а также массовыми коэффициентами внутренних органов, где отклонений от физиологических значений не установлено (рис. 2, 3). Кроме того, отличий второй контрольной группы от интактных мышей первой группы не наблюдалось. Изменения аминотрансфераз в данной группе животных предположительно свидетельствует о повышении активности данных ферментов в результате воздействия селена на их активные центры.

Таблица 2 - Биохимические показатели сыворотки крови мышей экспериментальных групп

Показатель	Ед. изм.	№ группы
		1	2	3	4	5	6	7	8
		0,89 % NaCl	nSe	CoCl 2	Hg(NO 3 ) 2	CdSO 4	nSe + CoCl 2	nSe + Hg (NO 3 ) 2	nSe + CdSO 4
АЛТ	Е/л	46	91	124	161	106	59	52	51
		±2,9	±6*	±7*	±12*	±9*	±9	±6	±8
АСТ	Е/л	118	163	216	155	206	107	116	115
		±12	±16*	±29*	±15*	±23*	±11	±8	±13
Щелочная фосфатаза	Е/л	113 ±5	123 ±11	296 ±23*	299 ±22*	204 ±21*	119 ±7	123 ±14	125 ±9
Мочевина	ммоль/	6,4	6,5	12,7	13,2	9,9	7,2	6,2	6,3
	л	±0,6	±0,6	±1,8*	±1,2*	±1,9*	±0,9	±0,9	±0,9
Креати-	ммоль/	25,1	26,1	81,2	95,8	82,5	24,5	26,1	24,9
нин	л	±1,3	±1,7	±4,4*	±8,5*	±4,4*	±2,1	±2,2	±1,4
Глюкоза	ммоль/	4,1	4,1	3,2	5,4	2,1	4,6	4,3	4,8
	л	±0,5	±0,5	±0,4	±0,4	±0,5*	±0,2	±0,7	±0,6
Белок	г/л	52	55	66	45,8	71	55	57	59
общий		±2,8	±6	±7*	±3,1*	±6*	±4	±3	±4
Альбу-	г/л	21,4	22,9	19,1	16,1	15,2	23,4	21,2	21,4
мин		±2,5	±2,1	±1,6	±1,6*	±1,1*	±1,6	±2,1	±1,4
Глобулин	г/л	35,4	33,4	44,7	31,2	56,6	32,8	33,2	32,7
		±3,9	±4,8	±4,3*	±2,4	±4,3*	±3,8	±5,1	±6,1

Примечание: * - Различие по данному показателю статистически достоверно между относительно первой интактной группы мышей (р<0,05 при t (p,n) =2,26)

Коэффиценты массы органов, %

□ 112  3 П4 5 I б П7 П8

Рисунок 2 - Массовые коэффициенты печени мышей экспериментальных групп

Коэффиценты массы органов, %

2,5

1 □ 2   3 ■ 4   5 С 6   7   8

Рисунок 3 – Массовые коэффициенты внутренних органов мышей экспериментальных групп

В третьей, контрольной группе животных наблюдалось достоверное повышение индикаторных ферментов печени, АЛТ в 2,7 раза и АСТ на 83%, а также мембранного фермента щелочной фосфатазы в 2,6 раза, что указывает на повреждение клеточных мембран гепатоцитов, что подтверждается нарушением белкового метаболизма на 27%, увеличение глобулиновой фракции белка на 28%, а также достоверным снижением концентрации сывороточной глюкозы на 22%. Наряду с этим в третьей группе мышей отмечали нарушение функциональной активности почек, о чем свидетельствуют повышенные показатели мочевины на 98% и креатинина в 3,2 раза относительно интактных животных (табл. 2). Также на вскрытии наблюдали гиперемию печени, кровоизлияния в сердечной сорочке. Увеличение массовых коэффициентов печени на 46%, сердца на 24% и селезенки на 35% (рис. 2, 3).

В четвертой контрольной группе мышей, которым вводили в течение 7 суток токсикант Hg(NO3)2 отмечали достоверное увеличение активности аланин-и аспартатаминотрансфераз в 3,5 раза и 31% соответственно, щелочной фосфатазы в 2,6 раза, что указывает на повреждения печени, а также достоверное снижение общего белка на 12% за счет снижения альбуминовой фракции на 25%, что свидетельствует о нарушении функциональной активности органа. Поражение мочевыделительной системы, вызванное введением токсиканта характеризует достоверное увеличение мочевины в 2 раза и креатинина в 3,8 раза в сыворотке крови мышей (табл. 2). Также установлено достоверное увеличение массовых коэффициентов печени на 32%, селезенки на 23% и сердца на 18% (рис. 2, 3).

В пятой контрольной группе мышей, которым на протяжении семи дней орально вводили сульфат кадмия, отмечается достоверное увеличение трансаминаз (АЛТ в 2,3 раза и

АСТ на 75%) и щелочной фосфатазы на 81%, наряду со снижением альбуминовой фракции белка на 29% и достоверным повышением глобулинов на 60%. Данный факт указывает на нарушение функциональной активности печени на фоне повреждения гепатоцитов (табл. 1). Кроме того, отмечается достоверное увеличение коэффициентов печени на 50%, почек на 37%, селезенки на 33% и сердца на 31% при снижении массы тела животных (рис. 2, 3).

В опытных группах мышей, которым на протяжении семи дней наряду с токсикантами вводили раствор наночастиц селена стабилизированных ТВИН-80 показатели сыворотки крови не выходили за пределы референсных значений, отличий показателей опытных групп от интактного контроля выявлено не было (табл. 1). Массы мышей и коэффициенты внутренних органов не отличались от контрольных значений первой группы животных, которым вводили 0,89% раствор NaCl (рис. 2, 3).

Выводы . Таким образом, установлено, что сконструированные наночастицы селена имеют размер 15-32 нм, относятся согласно ГОСТ 32644-2014 к 3 классу опасности. Пероральное применение раствора наночастиц селена стабилизированных ТВИН-80 мышам, в дозе 1 мг/кг по действующему веществу, в объеме 100 мкл, за 2 часа до введения токсиканта, препятствует токсическому действию хлорида кобальта, нитрата ртути и сульфата кадмия на организм животных.

Вышеизложенное позволяет утверждать, что наночастицы могут использоваться как средства для снятия отравлениями тяжёлых металлов.