Исследование зависимости антагонистических свойств грибов рода Trichoderma spp. от количественного содержания источника углерода в питательной среде

Вве^ение. В настоящее время многообещающей альтернативой химическому методу защиты растений от болезней, вызванными фитопатогенными грибами, является использование микроорганизмов, выступающих в качестве естественных антагонистов возбудителей болезней и продуцентов антибиотических веществ с фунгицидными свойствами.

В связи с длительным применением в сельском хозяйстве синтетических органических фунгицидов наблюдается тенденция к уничто^ению полезной почвенной микрофлоры и, как следствие, массовые заселения почв фитопатогенными грибами и сни^ение плодородия почв [4, 11]. Исходя из этого, в последнее время все больше внимания уделяется созданию биологических средств защиты растений от вредителей и болезней [5, 12].

В данном исследовании внимание направлено на микофильные грибы рода Trichoderma как наиболее перспективных продуцентов антибиотических веществ с фунгицидным спектром действия [8, 14]. Гриб-антагонист является одним из универсальных и эффективных агентов биологического регулирования болезней увядания и корневых гнилей многих культур, располагает рядом механизмов, дающих возмо^ность подавлять развитие возбудителей семенной, корневой и почвенной инфекции, а так^е болезней плодов и листьев [2, 3, 9].

Известно, что микромицеты рода Trichoderma spp. выделяют различные метаболиты: факторы роста (ауксины, цитокины и этилен), органические кислоты, внутриклеточные аминокислоты, витамины и свыше 100 антибиотиков. Ка^дый вид характеризуется специфичным набором метаболитов [1, 6, 10]. При выборе агента биоконтроля для создания средств защиты растений помимо селекции исходных штаммов микроорганизма и их метаболитов на способность синтезировать ферменты или токсины, вирулентность, продуктивность, фитокомпетентность, очень ва^ным является подбор оптимальной питательной среды для культивирования биологических агентов [8]. Состав питательной среды влияет на метаболизм микроорганизмов, приводя к синтезу различных соединений. В комплексе они могут действовать как поло^ительно, так и отрицательно на развитие растений [13].

Целью ^анной работы являлось исследование влияния качественного и количественного состава источника углерода в питательной среде на антагонистические свойства грибов рода Trichoderma.

Услови^, материалы и мето^ы. В качестве объектов исследования были использованы штаммы микромицета Trichoderma virens, Trichoderma harzianum и культура фитопатогена Fusarium oxysporum , как наиболее распространенный вид возбудителей болезней базовых сельскохозяйственных культур в Орловской области.

Для подбора оптимального источника углерода в качестве компонента питательной среды был выбран метод совместного взаимодействия метаболитов Trichoderma spp. с культуральной ^идкостью Fusarium oxysporum на микропланшетах в фотометре при 620 нм, контролем слу^ила питательная среда. Данная технология значительно сократила время подбора оптимальной питательной среды и позволила одновременно анализировать по две модифицированные среды в одном планшете [7]. Культуру грибов выращивали при комнатной температуре и внешнем освещении, без прямых солнечных лучей в 100 мл колбах со средой Чапека в течение 5 дней без встряхивания. Затем биомассу фильтровали в асептических условиях, центрифугировали при 6000 тыс. оборотах в течение 10 мин для оса^дения оставшихся спор. Затем фильтровали через 0,2 Мм стерильный ацетатный фильтр.

^ликвоты финальной культуры использовали в исследовании. Конидии Fusarium oxysporum были получены выращиванием в среде Чапека на агаре в течение 7 суток при комнатной температуре и внешнем освещении. Конидии собирали путем прокатки стерильных ватных тампонов по поверхности чашки Петри и переносили в стерильный среду Чапека. Концентрация спор – 0,5 мF.

Контроль роста мицелия проводили на микропланшетах в фотометре при 620 нм ка^дые 24 часа.

Результаты и обсу^^ение. Результат активности роста мицелия Fusarium oxysporum при искусственном совместном взаимодействии метаболитов Trichoderma spp. с культуральной ^идкостью Fusarium oxysporum представлен в таблице 1.

Таблица 1 – Результат активности роста мицелия Fusarium oxysporum при искусственном совместном взаимодействии метаболитов Trichoderma spp. с КЖ Fusarium oxysporum

Время экспозиции	Trichoderma harzianum				Trichoderma virens				Контроль
	CL o zr i—	05 X 05 CL ^	05 00 О CL 05 X 05 О	го co О 2 i_	CL О zr i—	05 X 05 CL ^	05 00 О CL 05 X 05 О	го co О 2 i_
0 сутки	0,002	0,003	0,001	0,003	0,003	0,001	0,005	0,003	0,003
1 сутки	0,016	0,017	0,014	0,011	0,009	0,013	0,008	0,013	0,013
2 сутки	0,045	0,041	0,026	0,047	0,030	0,032	0,022	0,037	0,021

Таким образом, исследование показало, что использование сахарозы в качестве компонента питательной среды в глубинном культивировании микромицетов Trichoderma spp. ингибирует рост и развитие фитопатогена. Так^е выявлено, что эффективным агентом являются метаболиты Trichoderma virens.

Для дальнейшего изучения влияния различных концентраций сахарозы в качестве источника углерода на антагонистические свойства Trichoderma sрр. были выбраны метаболиты Trichoderma virens. Культивирование микромицета проводили на модифицированной среде Чапека трех типов: с содер^анием сахарозы 50%, 75%, 100%. Для получения этилацетатного экстракта вторичных метаболитов были использованы посевные инокуляты 5-дневной и 10-дневной культуры. Для приготовления инокулюма фитопатогена чистую суточную культуру Fusarium oxysporum , выросшую на твердой (агаровой) среде Чапека, помещали в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Далее все суспензии микроорганизмов стандартизировали по показателю мутности 0,5 по Мак-Фарланду, что соответствует концентрации 1,5 х 10 ⁸ КОЕ/мл. Затем, предварительно полученные методом серийных разведений рабочие растворы наносили на предметные стекла в объемах 10 мкл и 50 мкл для вторичных метаболитов Trichoderma virens и 50 мкл для фитопатогена Fusarium oxysporum и помещали их в чашки Петри. Через 24 часа препарат фиксировали для дальнейшего микроскопирования и оценки результата.

^нтагонистические свойства оценивали по прорастанию конидий Fusarium oxysporum и формированию его мицелия. Результаты микроскопирования представлены в таблице 2, 3.

Таблица 2 – Результаты культивирования фитопатогена Fusarium oxysporum с метаболитами Trichoderma virens в объёме 10 мкл

Содер^ание сахарозы в среде Чапека для глубинного культивирования гриба, % от нормы	Совместное культивирование Fusarium oxysporum с метаболитами, выделенным из 5-сут. культуры гриба Trichoderma virens
	10 мкл
	0 день	Через 24 часа
50	1W^	- --*':      t‘^\ / / . Ч WVV
75
100	AXJL Z -f^W L. '

Таблица 3 – Результаты культивирования фитопатогена Fusarium oxysporum с метаболитами Trichoderma virens в объёме 10 мкл

Содер^ание сахарозы в среде Чапека для глубинного культивирования гриба, % от нормы

Совместное культивирование Фузариум с метаболитами, выделенным из 5-сут. культуры гриба Триходерма 50 мкл

0 день                  Через 24 часа

Выво^ы. Полученные данные позволяют сделать вывод об обратной зaвисимости антагонистической активности Trichoderma virens от количественного содер^ания углерода в модифицированной среде Чапека. Чем меньше количество сахарозы в среде при культивировании, тем антагонистические свойства микромицета Trichoderma virens в отношении Fusarium oxysporum были более выра^ены. Bмeсте с тем, 10-дневная посевная культура Trichoderma virens так^е обладала более сильной антагонистической активностью в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum по сравнению с 5дневной культурой. Эти результаты могут быть использованы для подбора оптимальных условий культивирования грибов рода Trichoderma с целью получения максимальной антагонистической активности в отношении фитопатогенов и для дальнейшей разработки средств биоконтроля.