Изменение аллелотипов гена BоLA-DRB3 у коров -бруцеллоносителей аулиекольской породы Казахстана

В последние десятилетия в мире динамично развивается генетическая оценка крупного рогатого скота с применением ДНК-технологий [3] Применение ДНК-маркеров позволило проводить оценку племенных животных по важным хозяйственно-ценным признакам, выявлять особи с предрасположенностью к опасным генетическим, паразитарным и инфекционным заболеваниям [5]. При этом особое значение имеет исследование системы BoLA – главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота, и генов BoLA, ответственных за устойчи-вость/восприимчивость к болезням [1].

В мире многими учеными изучаются ассоциативные связи между геном BoLA-DRB3 и устойчивостью восприим-чивостьи крупного рогатого скота к различным инфекционным заболеваниям [4], что в дальнейшем позволит использовать иммуногенетический мониторинг в селекции на резистентность КРС к заболеваниям. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 (более 100 аллелей) связан с формированием защитных реакций и с устойчивостью разных пород крупного рогатого скота к вирусным, бактериальным, паразитарным заболеваниям [7, 9]. На настоящий момент достоверно установлен целый ряд маркеров, связанных с устойчивостью крупного рогатого скота к паразитам (трипаносома, сальмонелла и др.), а также к лейкозу, маститу, анкилозирующему спон- дилиту, туберкулезу, нодулярному дерматиту.

В России особую актуальность имеют работы по генетической устойчивости к вирусу лейкоза КРС коров [6, 11] в связи с широкой распространенностью лейкоза - 58,2 % от общего числа инфекционных заболеваний. Так, многочисленными исследованиями доказана корреляция восприимчивости животных к лейкозу с аллелями *8, *16, *22 и *24, в то же время особи, несущие аллели *11, *23 и *28, не заболевали лейкозом, несмотря на виру-соносительство [7, 10].

Бруцеллёз занимает второе место по распространенности среди инфекционных заболеваний КРС после лейкоза в России. В Республике Казахстан эта инфекция также широко распространена среди крупного и мелкого рогатого скота, бруцеллез регистрируется в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот в Северном и Центральном, реже в Западных, Восточных и Южных регионах [2].

Возбудители бруцеллеза коров и овец – бактерии Brucella abortus и Brucella melitensis, способны поражать человека. Бруцеллез является наиболее распространенным в мире антропозоонозным инфекционным заболеванием, он широко встречается во многих странах, является одной из самых серьезных проблем как ветеринарии, так и здравоохранения, так как представляет серьезнейшую опасность для здоровья людей. По данным ФАО/ВОЗ летальность у зараженных людей бруцеллезом может достигать 2-5%. Заболеваемость людей коррелирует с уровнем поражения бруцеллезом крупного и мелкого рогатого скота, ежегодно регистрируются свежие случаи заболевания людей острой формой бруцеллёза. Проблема ликвидации бруцеллеза представляет значительные трудности вследствие широкого распространения, наличия скрытых форм течения инфекции, вариабельности и убиквитарности возбудителя болезни. Ранее для оценки поголовья крупного рогатого скота на устойчивость – восприимчивость к бруцеллезу использовали иммуногенетические маркеры [3, 8].

В настоящее время в мировой литературе отсутствуют данные об изменении полиморфизма гена BoLA-DRB3 у больных бруцеллезом коров и, соответственно, наличии корреляции каких-либо аллелей этого гена с устойчивостью животных к Brucella.

Целью настоящей работы является анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 у здоровых и больных бруцеллезом коров, аулиекольской породы из разных регионов республики Казахстан и выявление аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к бруцеллезу.

Материал и методы исследований. Исследования были проведены на 158 образцах геномной ДНК КРС - здоровые коров - 84 пробы, больные бруцеллезом коров - 74 пробы из трех областей Казахстана: Карагандинской, Костанайской и Алматинской.

Выявление инфицированных животных проводили в ходе постановки общепринятых серологических реакции. В качестве контроля использовали образцы крови здоровых животных пропорционально количеству больных коров из этих регионов. Для проведения работы были использованы образцы цельной крови здоровых и больных животных крупного рогатого скота аулиекольской породы.

Анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ проводили согласно методике [7]. Метод ПЦР-ПДРФ для анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 животных включает несколько этапов работы:

• -    выделение ДНК из образцов крови, анализ полученных образцов методом электрофореза в агарозном геле,

• -    проведение ПЦР с праймерами к гену BoLA-DRB3 и получение фрагмента длиной 284 п.о., анализ полученных ампликонов методом электрофореза в агарозном геле,

• -    рестрикция ампликона 284 п.о. эндонуклеазами RSAI, BstIY и/или HaeIII,

• -    получение спектров рестриктных фрагментов методом вертикального электрофореза в ПААГ,

• -    анализ длин рестриктных фрагментов гена BoLA-DRB3,

• -    определение генотипов животных по гену BoLA-DRB3,

• -    определение разных аллелей гена BoLA-DRB3 в изучаемой группе животных.

Результаты исследований. Изучение генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ основано на амплификации фрагмента данного гена длиной 284 п.н. с его последующей рестрикцией и изучением длин, полученных рестрикционных фрагментов.

На этапе проведения ПЦР с праймерами к гену BoLA-DRB3 были получены фрагменты длиной 284 п.о. (Рис. 1).

Фрагмент ДНК длиной 284 п.о. подвергали параллельной рестрикции эндонуклеазами RsaI и HaeIII. Если полученные рестрикционные спектры не позволяли определить аллель, то дополнительно проводили рестрикцию ампликона с помощью фермента BstX2I. Полученную смесь продуктов расщепления ДНК анализировали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле, определяя длины фрагментов.

Примеры электрофоретических спектров приведены на рисунках 2 (а, б).

IIIIP. Бруцеллез. Аул не колье кая порода

1     2     3     4     5     6     7     8     9 1О 11    12   13    14   15    16    17    18

19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36

Рисунок 1 – Электрофорез в 1% агарозном геле продуктов ПЦР экзона 2 гена BoLA DRB3

а)                                                     б)

Рисунок 2 – Электрофореграммы продуктов рестрикции фрагмента гена BoLA-DRB3 длиной

284 п.н. эндонуклеазами а) RsaI, б) HaeIII

Аллели и генотипы по гену BoLA-DRB3 изучаемых животных определяли по рестрикционным спектрам с использованием таблицы рестриктных фрагментов гена BoLA-DRB3 [7]. Аллели различаются между собой наличием или отсутствием определенных сайтов рестрикции. Частоты встречаемости разных аллелей гена BoLA-DRB3 в изучаемых выборках здоровых и больных бруцеллезом коров представлены на рисунке 3, которые позволяют провести сравнение аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 у здоровых и больных бруцеллезом коров аулиекольской породы. Наиболее часто встречающиеся (более 5%) аллели гена BoLA-DRB3 у здоровых коров и бруцеллоносителей представлены в таблице 1.

Рисунок 3 – Частоты аллелей гена BoLA-DRB3 у здоровых коров и бруцеллоносителей аулиекольской породы

Таблица 1 – Наиболее распространенные аллели гена BoLA-DRB3 в группах здоровых коров и бруцеллоносителей аулиекольской породы

Аллели, %	Здоровые коровы	Больные коровы
3	8,9	2,7
4	5,9	1,3
19	6,6	1,3
21	6,6	1,3
7	5,9	16,2
10	2,4	13,5
18	3,0	11,5
36	6,6	10,8

Заключение. Результаты исследования, представленные на рисунке 3 и в таблице 1, выявили в популяции из 84 голов здоровых коров аулиекольской породы 24 аллеля, среди них наиболее распространенным является аллель *3 (8,9 %), аллели *4, *7, *12, *16, *19, *20, *21, *36 встречаются с частотой более 5 %. В группе из 74 голов больных бруцеллезом коров ау-лиекольской породы выявлено 22 аллеля, среди них наиболее распространенными являются аллели *7 (16,2 %), *10 (13,5 %), *18 (11,5 %), *36 (10,8 %) и *12 (6,1 %).

Сравнение групп здоровых коров и бруцеллоносителей по наиболее распространенным аллелям гена BoLA-DRB3 показало, что у здоровых животных аулие-кольской породы частота аллелей *3, *4, *19, *21 выше чем в группе больных коров в 3-5 раз.

В группе больных бруцеллезом коров наблюдается высокая частота встречаемости аллелей *7, *10, *18 и *36, у здоровых животных эти аллели встречаются в несколько раз реже (1,6 – 5,6 раз). Это может свидетельствовать о том, что эти аллели могут быть связаны с восприимчивостью животных к бруцеллезу.

Behl [et al.] // ISRN Veterinary Science. – 2012. – 12 p.

Резюме

Методом ПЦР-ПДРФ с помощью ДНК-маркеров на основе аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 изучены здоровые и больные бруцеллезом коровы аулиекольской породы из разных регионов Республики Казахстан. В группах здоровых животных и бруцеллоноси-телей выявлено 24 и 22 аллелей соответственно, что свидетельствует о достаточно высоком генетическом разнообразии поголовья аулиекольской породы Казахстана. У здоровых коров наиболее часто встречается аллель *3. Выявлено наличие аллелей гена BoLA-DRB3, характерных для больных животных - *7, *10, *18 и *36. Эти аллели могут быть связаны с восприимчивостью к бруцеллезу животных аулиекольской породы.