Изменение герминативно-фолликулярного индекса у инфицированных животных

Селезенка является одним из самых сложных периферических органов иммунной системы, обеспечивающим активный контакт иммунокомпетентных клеток с антигенами. Морфометрический метод позволяет дифференцировать патологический процесс, возникший на определенных сроках инфицирования животных, характерных для развития тех или иных патологий [5]. Таким образом, исследователю открывается более обширное представление о данном виде инфекции, что несомненно оказывает благотворное влияние на развитие науки и позволяет разрабатывать новые методы диагностики, профилактики и лечения, а также дает возможность усовершенствовать старые методы и внедрять их в работу научных организаций и животноводческих хозяйств, для более эффективной борьбы с данным видом заболевания [1]. В сравнении с другими органами, селезенка отличается более выраженной чувствительностью к микобактериям туберкулеза и их токсинам. От момента попадания туберкулезного инфекционного агента в ткани и до возникновения первых симптомов туберкулезного поражения, может пройти короткое время. В ряде случаев наблюдается так называемое молниеносное развитие данного заболевания [4].

Исследование структурнофункциональных особенностей селезенки остается актуальной проблемой при реакции инфекционного агента на ранних сроках для отслеживания динамики иммунных процессов.

Целью настоящего исследования стало изучение динамики изменения герминативно-фолликулярного индекса на ранних сроках заражения туберкулезом.

Материал и методы исследований. Работа выполнена в отделе ветеринарии (ВНИИБТЖ) ФГБНУ «Омского АНЦ». Исследования проведены на 20 половозрелых морских свинках самцах, содержащихся в условиях специализированного вивария для проведения опытов с микобактериями. Сформированы 3 группы животных по 5 голов. 10-ти морским свинкам подкожно вводили вирулентную культуру Mycobacterium bovis штамм 8 в дозе 0,001 мг/мл. Животным контрольной группы (n=10) вводили стерильный физиологический раствор в дозе 1 мл. Животных выводили из эксперимента на 7-и 14-е сутки после заражения путем декапитации. Перед инфицированием и убоем животных исследовали ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 25 МЕ в 0,1 мл внутрикожно. Учет реакции осуществляли через 72 часа. По результатам реакции у животных опытных групп имелись специфические уплотнения, а у контрольных животных никаких изменений не было.

Материалом для морфометрических исследований служит препарированная селезенка от экспериментальных морских свинок.

При проведении гистологических исследований пользовались стандартные методы фиксации органа в 10 % нейтральном формалине, заливкой в парафин с использованием станции проба подготовки STP-120 и станции заливки EC-350. На микротоме роторного типа готовили срезы толщиной 3-5 мкм, размещали на предметных стеклах с последующей окраской по классической методике гематоксилином и эозином. После окраски срезы заключали в синтетическую заливочную среду и покрывали стандартными по толщине покровными стеклами [3].

Микрофотосъемку и морфометрическую обработку гистологических препаратов, и их оцифровку проводили на микроскопе Axio-Imager A1 с использованием компьютерного программного комплекса Axiovision ver-4.7.

Морфометрические исследования проведены в контрольной и опытной группах. Определили: диаметр лимфоидных узелков (D лф ); диаметр герминативных центров (D гц ). И рассчитывали процентный герминативнофолликулярный индекс (ГФИ).

ГФИ= (D гц/ D лф)* 100

Измерения проводились в 15 полях зрения каждого объекта. Значимость различий между показателями экспериментальной и контрольной групп оценивали с помощью критерия Стьюдента. В работе приводятся показатели: М – средняя арифметическая величина; m – средняя ошибка средней арифметической величины. Достоверным считали отличия при Р<0,05.

Результат исследований. Анализ полученных в ходе исследования данных показывает, что количественные параметры и рассчитанный на их основе индекс претерпевают значительные изменения, выраженные в разной степени, имеющие различный вектор направленности и аритмичную динамику.

По результатам микроскопических и морфометрических исследований, на 7 сутки в опыте у зараженных животных отмечаются следующие изменения в лимфатических узелках (в сравнении с интактными животными).

Лимфоидные фолликулы увеличены, имеют округлую форму и состоят из плотно прилегающих друг к другу мелких лимфоцитов, среднее значение диаметра лимфоидных фолликулов 206,72±28,229 мкм (р≤0,05), что свидетельствет о гиперплазии фолликула. Реактивный центр, повторяет форму фолликула и окрашен в светлый тон, образован В-лимфоцитами, пролиферирующими и дифференцирующимися в плазматические клетки в ответ на антиген, можно судить о снижении общей иммунной функции селезенки связаной с подавлением иммунного ответа гуморального типа, то есть с угнетением В-клеточного иммунитета. Среднее значение реактивного центра – 84,47±17,450 мкм (Р≤0,05) (Таблица 1). Герминативнофолликулярный индекс увеличивается в 1,3 раза, отражая напряженность гуморального иммунитета и отчасти Т-клеточного звена иммунного ответа.

Таблица 1 – Размеры лимфоидных фолликул в селезенке морских свинок инфицированных туберкулезом, M±m

При исследовании структуры лимфоидных фолликул на 14 сутки прогрессируют изменения в сравнении с предыдущим сроком. Лимфоидные фолликулы увеличены, овальной формы, контуры между зонами нечеткие, размытые. Отдельные фолликулы сливаются друг с другом. Среднее значение размера лимфоидных фолликулов 272,57±14,958 мкм (Р≤0,001). Герментотивный центр окрашен в светлый тон, увеличен и имеет форму лимфотического узелка, с ярко выраженными границами. Среднее значение реактивного центра 181,82±11,606 мкм (Р≤0,001). Герминативно-фолликулярный индекс увеличен в 1,6 раза по сравнению с предыдущим сроком и в 2 раза по сравнению с контролем.

Заключение. Таким образом, Mycobacterium bovis штамм 8 оказывает на селезенку значимое воздействие на ранних сроках заражения. Через 7 дней после инфицирования происходит увеличение лимфоидного узелка на 30 % и возрастает герминативно-фолликулярный индекс. Более выраженные изменения происходят на 15 сутки. Лимфоидные узелки сливаются и укрупняются, увеличиваются на 47 % (от контроля) и на 24 % от предыдущего срока исследования. Центр просветления лимфоидного узелка на 7 сутки увеличился на 46 % от контроля, а на 14 сутки – на 54 % от предыдущего срока. Заметно происходит увеличение герминативнофолликулярного индекса в 2 раза в сравнении с контролем.

Гистоморфометрические показатели фолликулов динамично увеличиваются, что ведет к активации реакции гуморального и клеточного иммунитета.

Резюме

Посредством гистоморфологических методов изучена динамика изменений герминативно-фолликулярного индекса, характеризующего морфофункциональное состояние белой пульпы селезенки животных, зараженных Mycobacterium bovis шт. 8 в дозе 0,001 мг/мл. Опыт проводили на модели морской свинки (n=20). Выведение животных из опыта на 7 и 14е сутки после заражения методом декапитации, с последующим выделением селезенки, ее фиксации и заливки в парафиновые блоки. Морфологические и морфометрические исследования включали: диаметр лимфоидных узелков, диаметр герминативных центров и процентный герминативно-фолликулярный индекс. Измерения проводились в 15 полях зрения каждого объекта. Установлено, что лимфоидные узелки увеличиваются и меняются по форме, герминативно-фолликулярный индекс увеличивается в зависимости от сроков заражения в прогрессирующей динамике. Увеличение гистоморфометрических показателей фолликулов ведет к активации реакции гуморального и клеточного иммунитета с последующим развитием туберкулезного процесса и приводит к деструктивным изменениям в селезенке, что является следствием утраты своих иммунологических и лимфопоезных функций, тем самым позволяя туберкулезу развиваться с большей интенсивностью.