Изменение показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови доноров после инкубации с наночастицами диоксида кремния

Наночастицы - инженерно спроектированные микроскопические образования, имеющие размеры не более 100 нм. По заданию Роспотребнадзора в ГУ НИИ питания РАМН совместно с рядом научно-исследовательских учреждений РАН, РАМН и РАСХН, а также МГУ им. М.В. Ломоносова был разработан проект «Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, токсичности, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», который был утвержден постановлением Главного Государственного санитарного врача РФ №79 от 31.10.07 [7]. В литературе различают естественные и искусственные наночастицы. Естественные биологические и небиологические наночастицы не являются новыми факторами для человека. Примером естественных биологических наночастиц являются вирусы, небиологических - компоненты дымов от сгорания моторных топлив, сварочного аэрозоля, входят в состав воздуха, воды, почв, донных отложений, образуются в значительных количествах при лесных пожарах и вулканических извержениях, а также в результате функционирования теплоэлектростанций и в других высокотемпературных технологических процессах. Искусственные наночастицы были созданы сравнительно недавно и представляют новый фактор воздействия на окружающую среду и организм человека [5]. Области применения современных наноматериалов разнообразны и включают биомедицину, химическую промышленность, оптику, энергетику, строительство, электронику, косметологию, производство пищевых продуктов и товаров народного потребления [8]. Но в то же время возникают сложные научные проблемы, связанные с воздействием наночастиц на организм человека, и опасность вмешательства нанофактора в процессы физиологиче ской жизнедеятельности, протекающие в клетке, а отсюда вопросы - как поведут себя искусственно собранные наночастицы, каковы будут особенности их метаболизма в клетке, воздействуя на систему рецептор-медиатор, как будет протекать транспорт токсиканта в клетке, а также возможность влияния на механизмы регуляции синтеза белка и на генные структуры в клетке [6].

Согласно современным данным самым распространенным в биосфере нашей планеты после кислорода является кремний. Он входит в состав атмосферного воздуха, песка, кварца, горного хрусталя, стекла. Мышечная ткань человека содержит (1-2)-10~2 % кремния, костная ткань - 17-10-4 %, кровь - 3,9 мг/л. С пищей в организм человека ежедневно поступает до 1 г кремния. Анализ данных литературы показал, что наночастицы обладают более высокой токсичностью по сравнению с обычными микрочастицами [2]. Есть данные, что в форме наночастиц различные материалы приобретают новые, ранее неприсущие им свойства и биологические свойства [4]. Установлено, что наночастицы обладают высокой проникающей способностью: легко проникают через мембраны клеток, обнаруживаются в клеточном ядре, преодолевают гематоэнцефалический барьер, циркулируют и накапливаются в органах и тканях, вызывая выраженные патоморфологические поражения внутренних органов, а также обладают длительным периодом полувыведения. Эффекты, вызванные попаданием наночастиц в мозг, сердечно-сосудистую систему, печень и другие жизненно важные органы могут быть опасны для здоровья и жизни человека и животных. Наночастицы обладают большой удельной поверхностью, что увеличивает их адсорбционную ёмкость и каталитические свойства. Это может приводить к увеличению продукции свободных радикалов и активных форм кислорода и далее - к повреждению биоструктур (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) [7]. Токсичность наночастиц зависит от формы, размера, и других физико-химических особенностей строения, а также дозы, способа введения, концентрации и продолжительности влияния на организм [2].

Токсичность наночастиц диоксида кремния для животных и человека изучена слабо, однако широта спектра их применений ставит их на одно из первых мест в списке наночастиц, требующих детального изучения их биологических свойств.

Одними из главных представителей клеток иммунной системы, а также клетками «первой линии» противоинфекционной защиты - являются нейтрофильные гранулоциты. Содержимое их первичных, вторичных и третичных гранул богато огромным спектром биологически активных продуктов. При активации нейтрофильные гранулоциты решают свои эффекторные задачи одним из двух способов: либо с помощью фагоцитоза, либо путем активации биологически активных веществ [3].

Приведенные факты свидетельствуют о необходимости проведения научно-исследовательских работ, касающихся токсичности, положительных или отрицательных биологических эффектов наночастиц и их биобезопасности. На данном этапе решения этой задачи возможность влияния наночастиц диоксида кремния на клетки иммунной системы человека остается открытым. Данных о токсическом влиянии наночастиц диоксида кремния на нейтрофильные гранулоциты нами не встретилось.

Цель работы: проанализировать функциональную активность нейтрофилов периферической крови после 3-часовой инкубации с наночастицами SiO₂ в концентрациях 1,О81О¹³, 0,54Т0¹³ и 0,27-10¹³ частиц/мл.

Материалы и методы. Объектом исследования были нейтрофилы, выделенные из периферической венозной крови доноров в возрасте 18-35 лет. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя составила 1,075-1,077, нижнего 1,093-1,095. После центрифугирования в течение 40 мин при 1500 об/мин нейтрофилы аккуратно собирали пипеткой, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Клеточную взвесь стандартизировали до концентрации 5 10⁶ клеток/мл путем подсчета в камере Горяева. Клетки инкубировали в присутствии различных концентраций (1,08 10¹³, 0,5410¹³ и 0,27Т0¹³ частиц/мл) наночастиц в течение 3 часов. Диаметр наночастиц составлял 9 нм. Наночастицы SiO₂ были любезно предоставлены НОЦ ЮУрГУ «Материаловедения и нанотехнологий» (руководитель - профессор Сапожников С.Б.), за что авторы выражают глубокую благодарность. Жизнеспособность клеток в культуре оценивали стандартным суправитальным окрашиванием

1 %-ным раствором трипанового синего. Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Для этого 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе смешивали с 0,02 мл 1 %-ного раствора трипанового синего, ресуспензировали. Клетки помещали в камеру Горяева и исследовали в световом микроскопе. Живые клетки были прозрачными (трипанонегативные клетки), мертвыми считались клетки, которые были окрашены в фиолетовый цвет (трипанопозитивные клетки). Подсчет производили на 100 клеток, результат выражали в процентах. Общее количество клеток подсчитывали также в камере Горяева, стандартным методом подсчета лейкоцитов. Функциональный ответ нейтрофилов крови оценивали по фагоцитарной активности нейтрофилов на модели поглощения частиц полистирольного латекса. Для этого смешивали 0,2 мл суспензии нейтрофилов в физиологическом растворе с 0,04 мл взвеси частиц полистирольного латекса, диаметром 1,7 мкм, и концентрацией 108 частиц/мл. После 30-минутной инкубации при температуре 37 °C из клеток готовили препараты, которые высушивали на воздухе, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии рассчитывали активность фагоцитоза - процент нейтрофилов, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза - число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах. С помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста проводилось определение способности к выработке активных форм кислорода. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму -диформазан. При этом темные гранулы диформа-зана выпадают внутри нейтрофилов и на их цитоплазматической мембране. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном (базальном) и индуцированном (стимулированном). Для постановки реакции вносили по 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе. В одну из них добавляли 0,04 мл физиологического раствора, во вторую добавляли 0,04 мл суспензии латекса (диаметр частиц 1,7 мкм, концентрация 108 частиц/мл). После этого во все пробирки вносили по 0,1 мл 0,2 %-ного раствора НСТ. Инкубировали в течение 30 мин при 37 °C, после инкубации материал центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, из осадка готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали 0,005 %-ным водным раствором сафранина в течение 5 минут. Учет проводили с помощью световой микроскопии по количеству гранул диформазана в нейтрофилах, используя полуколичественный метод оценки в «крестах». Определяли процент клеток, восстанавливающих НСТ (активность НСТ-теста), и интенсивность реакции восстановления НСТ. Для этого НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы: 1 - клетки с единичными гранулами диформазана в цитоплазме (+), 2 - клетки с цито-

Проблемы здравоохранения

плазмой, наполовину заполненной гранулами ди-формазана (++), 3 - клетки с цитоплазмой, полностью заполненной диформазаном (+++). Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток, оцененных в один крест, умножали на 1, в два креста - на 2, в три креста - на 3. Результаты ссумировали и делили на 100. Прижизненное исследование интенсивности люминесценции лизосом в цитоплазме фагоцитов, окрашенных акридиновым оранжевым, является одним из методов оценки состояния лизосомального аппарата клеток. Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Для этого 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе соединяли с 0,02 мл раствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Клетки инкубировали 30 мин при 37 °C. Клеточную взвесь помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и микроскопировали под масляной иммерсией в потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа. Определяли лизосомальную активность - число нейтрофилов, имеющих лизосомальные гранулы (%) [3]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных статистических программ Statistica 6.0, с вычислением средней арифметической и ее стан-

Показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при активации разными концентрациями наночастиц SiO2 (п = 10)

дартной ошибки (М ± т). Достоверность различий между изучаемыми группами оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни [1].

Результаты. В течение 3-часовой инкубации нейтрофилов с различными концентрациями (0,27-10¹³, 0,54-10¹³ и 1,0810¹³ частиц/мл) наночастиц диоксида кремния жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов с увеличением концентрации снижается по сравнению с контролем (см. таблицу).

В концентрации 0,54-1013 частиц/мл - в 1,04 раза и 1,08-1013 частиц/мл - в 1,16 раза. При оценке общего количества клеток показатели достоверно уменьшались: в концентрации 0,27-1013 частиц/мл -в 1,17 раза, в концентрации 0,541013 частиц/мл -в 1,36 раза и 1,08-10° частиц/мл - 1,86 раза по сравнению с контролем (см. таблицу). Соответственно, количество жизнеспособных клеток также достоверно снижалось при использовании всех концентраций наночастиц диоксида кремния.

При исследовании состояния функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов была отмечена активация клеток. Активность фагоцитоза в концентрации 0,27-1013 частиц/мл возросла 1,08 раза, в концентрации 1,081013 частиц/мл в 1,09 раза по сравнению с контрольной группой. Аналогичная тенденция прослеживалась и в показателях интенсивности фагоцитоза. В наименьшей концентрации интенсивность возросла в 1,38 раза, в максимальной концентрации в 1,52 раза. В концентрации 0,54-1013 частиц /мл достоверных отличий не отмечено (см. таблицу).

Спонтанная НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов была достоверна увеличена в концентрации 0,27-1013 частиц/мл в 1,3 раза, 0,54-1013 частиц/мл в 1,58 раза и в концентрации 1,081013 частиц/мл в 2,99 раза по сравнению с контрольной группой. Индуцированная НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов была также достоверно увеличена: в 1,4, 1,39 и 1,69 раза по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что в концентрации 1,081013 частиц/мл между показателями активности спонтанного и индуцированного НСТ-тестов происходит снижение резерва бактерицидной функции нейтрофилов. Лизосомальная активность была увеличена в концентрации 0,541013 частиц/мл в 1,33, а в 1,О81О13 частиц/мл 1,48 раза (см. таблицу). В доступной литературе аналогичных данных по исследуемой проблеме нами не встретилось.

Заключение. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что наночастицы диоксида кремния активируют нейтрофильные гранулоциты. Наибольший эффект наблюдается в концентрации 1,08-1013 частиц/мл, а наименьший - 0,27-1013 частиц/мл. При этом предположительно нейтрофильные гранулоциты при действии наночастиц диоксида кремния акти вируются, усиливаются метаболические процессы, протекающие в клетке, с последующей активацией функциональной активности с истощением бактерицидных потенциалов. После чего клетки разрушаются по типу некроза. Не исключена и активация механизмов апоптоза. По литературным данным жизнеспособность макрофагов после инкубации с частицами кремния в концентрации 50 мкг/мл уменьшилась в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой [10]. Также была отмечена активация моноцитов, перитонеальных макрофагов при воздействии частиц кремния. В результате клетки высвобождали большое количество ИЛ-1 и впоследствии подвергались апоптозу [9,10].