Изменения микробиома кишечника у пациентов с множественной миеломой при аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

Множественная миелома составляет 1% среди всех онкологических заболеваний, но 10–13% от общего числа гемобластозов и 2% летальных исходов среди всех злокачественных опухолей приходится на пациентов с ММ [1]. Высокодозная химиотерапия с последующей аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ау-тоТГСК) остается стандартом лечения множественной миеломы.

Появление новых лекарственных средств, таких как иммуномодулирующие препараты, ингибиторы протеасом и моноклональные антитела, не исключили аутоТГСК и сохранили ее важную роль в лечении больных ММ [2]. Однако значение микробиома при аутоТГСК изучено крайне недостаточно [3]. Между тем нарушение баланса кишечной микробиоты (дисбиотические состояния) приводят к развитию различных нарушений, в частности воспалительных заболеваний кишечника.

Считается, что ведущим фактором, способствующим воз- никновению нарушений микробиома, является антибактериальная терапия [4].

Целью нашего исследования явилось изучение изменений микробиома кишечника до аутоТГСК и после ее выполнения, у пациентов с множественной миеломой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Было обследовано 15 пациентов с ММ в возрасте 48–67 лет (медиана 60 лет), госпитализированных в ФГБУ РосНИ-ИГТ ФМБА России в период с февраля 2020 по февраль 2021 года для выполнения аутоТГСК. Режим кондиционирования состоял из высокодозной химиотерапии, включавший мел-фалан в дозе 200 мг/м2. Протокол исследования включал сбор и низкотемпературное замораживание образцов кала, полученных от больных до проведения аутоТГСК и в разные сроки от 7 до 35 дней после ее проведения. Среди критериев включения пациентов в исследование было наличие ≥ 3 последовательных секвенированных биологических образцов у одного пациента. После экстракции и очищения ДНК в каждом из биологических образцов выполнялась ПЦР-

Таблица 1. Демографическая и клиническая характеристика пациентов

Количество пациентов 15 Возраст (годы) 60 (48-67) Пол Мужской 6 Женский 9 Почечная недостаточность есть 3 нет 12 Заболевание Множественная миелома 15 Подтип IgGλ 5 IgGk 6 IgAλ 0 IgAk 1 БД k 3 Стадии ММ (по B. Durie, S. Salmon) IA 1 IIA 2 IIIA 10 IIIB 2 Приживление нейтрофилов (день) 12 (10-16) Фебрильная нейтропения 4 Инфекции Бактериемия 0 Легочные осложнения 0 Инфекции мочевыводящих путей 0 амплификация V5 региона гена 16S рРНК с помощью модифицированных универсальных бактериальных праймеров. Очищенные ПЦР-продукты секвенировали с помощью платформы MiSeq Illumina. Филогенетическая классификация до видового уровня выполнялась на основании базы данных Illumina. Учитывали возраст, пол пациентов, состояние функции почек, стадию ММ (по B. Durie, S. Salmon) (табл.1). Приживление нейтрофилов после АТГСК определялось как первые 3 дня подряд с абсолютным числом нейтрофилов ≥500 клеток/мм3 (0,5х109/л).

Всем пациентам проводили стандартную профилактику инфекций флуконазолом и ацикловиром. При развитии фебрильной нейтропении больные получали антибиотики, обладающие активностью в том числе в отношении нозокомиальных грамотрицательных патогенов. Оценку токсичности осуществляли в соответствии с общими терминологическими критериями нежелательных явлений (CTCAE) Национального института рака, версия 4.03 [5].

СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Статистический анализ данных реализован в среде программирования для статистической обработки данных R. Диаграммы размаха построены с помощью пакета ggpubr. Сравнение независимых групп осуществлялось с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса (с последующим апостериорным попарным сравнением) и Манна-Уитни. Сравнение связанных групп проводилось с помощью критериев Фридмана (с последующим апостериорным попарным сравнением и Уилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Время приживления нейтрофилов составило 12 дней

(диапазон от 10 до 16 дней). Фебрильная нейтропения наблюдалась у 4 пациентов. Желудочно-кишечная токсичность 2–3 степени выявлена в 4 (27%) случаях. Всего за время наблюдения было собрано и секвенировано 58 образцов биологического материала.

На первом этапе исследования был изучен индекс альфа разнообразия микробиома (индекс Шеннона) в разные периоды аутоТГСК. Выявлено достоверное (p=0,0215) снижение индекса разнообразия в период после проведения аутоТГСК (рис.1).

Надо отметить, что влияние АутоТГСК достаточно подробно изучено именно в контексте микробиома. В частности, было показано достоверное снижение индекса биологического разнообразия микробиома (индекс Шеннона) у пациентов в динамике при проведении аллоТГСК, при этом выявлен негативный эффект антибиотиков и химиопрепаратов на многообразие микробиома. Кроме того, установлено, что эффект разнообразия микробиома является независимым фактором риска трансплантат-ассоциированной летальности в течение нескольких лет после аллоТГСК. Наши данные показывают, что достоверное снижение индекса биологического разнообразия микробиома (индекс Шеннона) наблюдается и при аутоТГСК. Анализ результатов изучения индекса разнообразия у отдельных больных (рис. 2) показал, что в 6 случаях наблюдалось снижение индекса Шеннона. В трех случаях данный показатель не изменился, и только у одного больного наблюдалось повышение индекса разнообразия в ранние сроки после ТГСК.

Известно, что разнообразный, высокодифференцированный кишечный микробиом имеет защитный эффект против ряда инфекций, включая способность предотвращать колонизацию кишечника высокоустойчивыми патогенами [6-7]. Применение антибиотиков является основным фактором, способствующим обеднению микробиоты и развитию дис-биотических состояний. Антибиотики способствуют отбору полирезистентных энтеробактерий. Среди полирезистент-ных бактерий весомую долю составляют энтеробактерии с продукцией β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Колонизацию кишечника энтеробактериями с продукцией БЛРС надо рассматривать как предиктор развития бактериемий, вызванных тем же видом бактерий. В одном из наших исследовании [8] энтеробактерии с продукцией БЛРС были выявлены в 24% культур, выделенных у иммуносупресси-рованных онкогематологических пациентов, причем у всех 3 штаммов, выделенных из крови. Выявление в кишечнике энтеробактерий с продукцией БЛРС, вероятно следует расценивать как предиктор развития бактериемий, вызванных тем же видом бактерий [9].

Wikoxon pared test = 20 1 ■ p value = 0 0215

до аутоТГСК

7-35 день после аутоТГСК

Рисунок 1. Индекс разнообразия микробиоты кишечника до и после проведения аутоТГСК

Рисунок 2. Индекс разнообразия микробиоты кишечника у пациентов до ТГСК и после ее проведения.

Далее нами были проведены исследования изменения отдельных бактериальных типов в разные периоды после трансплантации с помощью парного теста Уилкоксона. Изучены особенности изменения состава микробиоты на уровне типа до и после аутоТГСК (рис. 3). Установлено, что изменение микробиоты на уровне типа выявлено только в отношении Actinobacteria (Wilcoxon paired test = 18, p=0,0184). Достоверных изменений на уровне типов Bacteroides, Firmicutes, Proteobacteria не обнаружено.

Мы исследовали также возможную связь изменения микробиоты кишечника и развития желудочно-кишечной токсичности. На наш взгляд, использование высоких доз мелфалана и проти-вомикробных препаратов у пациентов, подвергающихся аутоТГСК, приводит к микробному дисбактериозу желудочно-кишечного тракта, что значительно снижает качество жизни больных. Результаты этой серии исследований представлены на рисунке 4. Показано, что при 2 степени токсичности в микробиоте наблюдалось достоверное снижение Bacteroides (Mann–Whitney U test=16, p=0,044) по сравнению с группой больных, у которых выявлена 1 степень токсичности.

Нами проведено также исследование изменений кишечной микробиоты при развитии фебрильной нейтропении (рис.5)

до аутоТГСК

7-35 день после аутоТГСК

Показано, что при развитии фебрильной нейтропении наблюдается достоверное (Mann–Whitney U test=38, p=0,04) снижение типа Proteobacteria. Это может быть связано с немедленным назначением эмпирической антибактериальной терапии при фебрильной нейтропении, направленной в первую очередь на грамотрицательные возбудители, что существенно снижает плотность Proteobacteria в кишечном микробиоме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ до аутоТГСК

7-35 день после аутоТГСК

Рисунок 3. Изменение относительной численности фекальных бакте-риомов на уровне типа.

Здесь показаны 4 самых многочисленных типа. Столбцы на левом графике - до аутоТГСК, на правом - на 7-35 день после аутоТГСК. * - значимые различия между группами.

Состояние микробиоты у больных гемобластозами привлекает пристальное внимание исследователей с начала 80-х годов прошлого века. Исследованиями последнего десятилетия показана ключевая роль микробиоты при аллогенной ТГСК у больных гемобластозам. Вместе с тем следует отметить, что его значение при отдельных видах гемобластозов, в частности, при множественной миеломе, имеет свои особенности и требует дальнейшего изучения [4]. Кроме того исследования микробиома касаются в основном аллогенной трансплантации. Слабее изучена его роль при аутологичной ТГСК.

Наше исследование показало, что состав микробиоты в ранние сроки после трансплантации коррелирует с тяжестью желудочно-кишечной токсичности (оцениваемой по частоте эпизодов тош-

более 1-2р/д более 1-2р/д

1-2Р/Д

Firmicutes

Рисунок 4. Изменение относительной численности фекальных бакте-риомов при 1 степени и 2 степени желудочно-кишечной токсичности

Firmicutes                            Proteobacteria

36,6 выше 36,6                  36,6 выше 36,6

Рисунок 5. Блок-схемы изменений относительной численности фекальных бактериомов на уровне типа.

ноты и рвоты). Так, при второй степени токсичности (частота эпизодов тошноты и рвоты 3-5 в день) по сравнению с первой степенью (частота эпизодов 1-2 раза в день) наблюдалось значимое (p=0,044) снижение типа Bacteroides в кишечной микробиоте. Эти данные подтверждаются наблюдениями El Jurdi N. et al. [4]. В частности, описана более низкая токсичность [5] у пациентов ММ с высоким содержанием типа Bacteroides в кишечной микробиоте в ранние сроки после проведения АутоТГСК. Нами установлена также взаимосвязь состава кишечной микробиоты и случаев фебрильной нейтропении при АутоТГСК у пациентов с ММ, что подтверждает ранее опубликованные результаты [4]. Кроме того, выявлено значимое (р=0.04) снижение типа Proteobacteria при фебрильной нейтропении при ММ, что может быть объяснено ранними эффектами эмпирической антибактериальной терапии на микробиту кишечника.

Таким образом, несмотря на сравнительно небольшое количество обследованных пациентов в данном пилотном клиническом исследовании, нами установлена достоверная связь изменений микробиоты с желудочно-кишечной токсичностью и развитием фебрильной нейтропении.

Конфликты интересов отсутствует Источник финансирования Исследование не имело источника финансирования

Вклад авторов

Концепция и дизайн: все авторы Сбор и обработка данных: все авторы Предоставление материалов исследования: все авторы

Анализ и интерпретация: все авторы Подготовка рукописи: все авторы Окончательное одобрение рукописи: все авторы