Изучение биологических и физико-химических свойств изолята вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

Вирус парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота вызывает тяжелую форму инфекции при интенсивном животноводстве. Это один из наиболее распространенных возбудителей респираторных инфекций у крупного рогатого скота и овец, особенно у молодняка [2, 10].

Первичная инфекция ПГ-3 обычно сопровождается вторичными бактериальными инфекциями, которые могут привести к гибели животного. Неблагоприятные факторы окружающей среды, такие как низкая температура, высокая влажность, загазованность помещений и неполноценное кормление, могут также влиять на течение заболевания молодняка крупного рогатого скота. Источниками инфекции являются больные животные, инфицированные ПГ-3, которые выделяют вирус в окружающую среду секретами [1, 3].

В некоторых случаях может развиться интерстициальная пневмония. Первичные инфекции обычно проходят через 3-4 дня без последствий. Иммунитет недолговечный, и через несколько месяцев эти животные подвержены реинфекции ПГ-3 [6].

Вирус парагриппа типа-3 может инфицировать широкий спектр млекопитающих, включая людей, домашних животных и диких животных. Также сообщалось о межвидовых инфекциях, например, BPIV-3 у людей и овец, а также овец и у крупного рогатого скота, BPIV-3 является одной из причин респираторного заболевания крупного рогатого скота (BRDC). Этот вирус может вызвать повреждение тканей и иммуносупрессию, приводящую к тяжелой бронхопневмонии, особенно когда животные находятся в стрессовых условиях [4, 7, 8, 9].

Поэтому, диагностика и профилактика респираторных заболеваний крупного рогатого скота на сегодняшний день считается актуальной проблемой ветеринарной медицины [2, 5, 10].

Целью данной работы являлось сравнительное изучение биологических и физико-химических свойств изолята «ЛД-9» с вакцинным и референтным штаммами вируса парагриппа-3 КРС.

Материал и методы исследований. Первоначальную идентификацию выделенного цитопатогенного агента проводили путем определения типа нуклеиновой кислоты в его геноме. С этой целью в качестве ингибитора синтеза ДНК использовали 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ). Учет реакции проводили титрованием обработанного материала на культуре клеток ПЭК. В качестве контроля использовали вакцинный штамм «ПТК-45/86» и референтный штамм «SF-4» вируса парагриппа-3 КРС.

Сохранение инфекционной активности цитопатогенного агента после обработки 5-БДУ давало нам основание считать, что изолят является РНК- содержащим вирусом, тогда как у ДНК-содержащих вирусов инфекционная активность снижается на 1,0 lg ТЦД 50/мл и ниже.

Дальнейшая идентификация вирусного изолята «ЛД-9» основывалась на определение его гемагглютнирующих и гемадсорбирующих свойств.

Реакцию гемагглютинацию (РГА) ставили макрометодом в лунках пластиковых панелей. С этой целью во все лунки панеля вносили по 0,4 см3 физиологического раствора с рН 7,2-7,4. Затем в первую лунку вносили 0,4 см3 вируссо-держащей культуральной жидкости и путем последовательного переноса в последующие лунки получали двукратно возрастающий ряд разведения. После чего во все лунки вносили по 0,4 см3 1 %-ой суспензии эритроцитов крупного рогатого скота, барана, кролика и морской свинки. Тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре. Учет реакции производили после оседания эритроцитов в контроле по 3-х, 4-х крестовой оценке агглютинации.

Реакцию гемадсорбции проводили на культуре клеток ЛЭК с использованием 0,5-ных взвеси эритроцитов вышеперечисленных животных. С этой целью через 610 часов после инфицирования культуры клеток исследуемыми вирусными материалами во флаконы добавляли по 0,2 см3 взвеси эритроцитов и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Затем флаконы осторожно промывали раствором Хенкса, чтобы освободиться от осевших на монослой эритроцитов и просматривали под малым увеличением светового микроскопа.

При положительной реакции на поверхности зараженных клеток наблюдали диффузную адсорбцию эритроцитов, тогда как в интактной культуре они отсутствовали. Оценку реакции проводили визуально по 4-х крестовой степени адсорбции эритроцитов на монослое культуры клеток. Дальнейшую идентификацию изолята вируса осуществляли путем изучения его физико-химических свойств.

Термостабильность изолята «ЛД-9» изучали при Т 56 0С. С этой целью про- бирки с пробами вирусного материала помещали в водяную баню с вышеуказанной температурой. После экспозиции 20, 30, 60 и 90 минут опытными пробами заражали культуру клеток. Снижение инфекционного титра более чем на 1,0 lg ТЦД 50/мл свидетельствовало о чувствительности изолята вируса к данной температуре.

Устойчивость вирусного изолята к различным значениям рН среды определяли по следующей методике. Первоначально при помощи 0,1 М раствора соляной кислоты доводили до соответствующего значения показатель рН поддерживающей среды. Затем 1 часть вирусного материала смешивали с 9 частями питательной среды соответствующей рН. После экспозиции в течение 3-х часов при комнатной температуре каждой пробой инфицировали культуру клеток. В качестве контроля использовали разведение вирусного материала в соотношении 1:10 в среде с рН 7,2. Устойчивость исследуемого изолята к различным показателям рН определяли по наличию ЦПД в монослое культуры клеток.

Таблица 1 – Изучение биологических и физико-химических свойств вируса парагриппа-3 КРС (n = 4)

№ п/п	Виды исследований	Единица измерений	Вакцинный штамм «ПТК-45/86 вируса ПГ-3	Референтный штамм «SF-4» вируса ПГ-3	Вирусный изолят «ЛД-9»
1	Инфекционная активность на культуре клеток	lg ТЦД 50/мл	6,75	7.25	6,25
2	Чувствительность к 5-БДУ	lg ТЦД 50/мл	6,5	7,0	6,0
3	Резистентность к эфиру	lg ТЦД 50/мл	0	0	0
4	Резистентность к хлороформу	lg ТЦД 50/мл	0	0	0
5	Инактивация при Т +560	минута	25	30	25
6	Чувствительность: к рН 8,0; к рН 5,0; к рН 3,0	lg ТЦД 50/мл	6,5 5,0 1,0	7,0 5,5 1,5	6,0 4,5 0,5
7	Способность агглютинировать эритроциты: кр. рог. скота; барана; кролика; морской свинки	Титр в РГА	1:8 1:2 1:2 1:16	1:16 1:4 1:4 1:32	1:8 1:2 1:2 1:8
8	Способность адсорбировать эритроциты: кр. рог. скота; барана; кролика; морской свинки	Визуальная оценка (+)	+++ ++ + ++++	+++ ++ ++ ++++	+++ + + ++++

С целью изучения чувствительности изолята вируса к эфиру, вируссодер-жащей культуральной жидкости добавляли эфир до 20 % концентрации. Флаконы плотно укупоривали пробками и помещали в холодильник при 4+7 0С на 18-20 часов, периодический перемешивая исследуемые материалы. Затем резиновые пробки заменяли ватными, и флаконы оставляли в холодильнике до полного испарения эфира. После этого проводили титрацию на культуре клеток опытных и контрольных образцов вирусного материала. Снижение инфекционного титра вируса на 1,0 lg ТЦД 50/мл и более свидетельствовало о его чувствительности к эфиру. Устойчивость вирусного изолята к хлороформу определяли по методу Mayr A., Bogel K. (З. Ляр-ский, 1980). Для этого исследуемый материал смешивали с 10 % объема хлороформа и встряхивали при помощи Шюттель-аппарата в течение 1 часа при 4 0С, после чего смесь оставляли при той же температуре до следующего дня. Затем опытный материал центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 30 минут. Образовавшуюся надосадочную жидкость титровали на культуре клеток в сравнении с необработанным вирусным материалом. Степень устойчивости вируса к хлороформу оценивали по изменению инфекционного титра в lg ТЦД 50/мл.

Результаты исследований. Результаты исследований биологических и физико-химических свойств вирусного изолята представлены в таблице 1. Дальнейшую идентификацию изолята осуществляли путем изучения его физико-химических свойств в сравнении с вакцинным и референтным штаммами вируса парагриппа-3. Так при определении резистентности вирусов к эфиру и хлороформу установлено, что после обработки препаратами штаммы полностью инактивировались. С целью изучения термостабильности изолята «ЛД-9» вирусный материал выдерживали при Т 56 ⁰С. В результате проведенных исследований установлено, что все 3 штамма инактивируются при данной температуре в течение 25-30 минут. В опытах по определению устойчивости вирусного изолята к различным параметрам рН установлено, что в щелочной среде вирус сохраняется лучше, чем в кислой.

Заключение. Таким образом, проведенные нами опыты по идентификации выделенного вирусного агента «ЛД-9» на основании изучения отдельных биологиче- ских и физико-химических свойств показали его идентичность с референтным и вакцинным штаммами вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Резюме

В данной статье представлены результаты изучения биологических и физикохимических свойств изолята вируса парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота. Установлено, что после обработки препаратом 5-БДУ всех 3-х испытуемых штаммов выявлено лишь незначительное (на 0,25 lg) снижение инфекционной активности. Данное обстоятельство свидетельствовало о том, что все они являются РНК-содержащими вирусами.

При постановке реакции гемагглютинации изолят вируса также как референтный и вакцинный штаммы ПГ-3 агглютинировал эритроциты морской свинки и КРС в титре 1:8, а также 1:2 эритроциты барана и кролика. Аналогичные результаты были получены и в реакции гемадсорбции. Все испытуемые штаммы вируса диффузно адсорбировали эритроциты вышеперечисленных животных.

При изучение физико-химических свойств изолята «ЛД-9» установлено, что он также как и референтный и вакцинный штаммы вируса ПГ-3 КРС чувствителен к воздействию эфира, хлороформа, Т +56 0С, рН 5,0 и 3,0.

Gueriche Achouak, Galiullin A.K., Gumerov V.G., Karimullina I.G., Summary

This article presents the results of a study of the biological and physicochemical properties of bovine parainfluenza-3 virus (PG-3) isolate. It was found that after treatment with the 5-BDU preparation of all 3 tested strains, only a slight (0,25 lg) decrease in infectious activity was revealed. This circumstance testified to the fact that they are all RNA-containing viruses.

When setting the hemagglutination reaction, the virus isolate as well as the reference and vaccine strains PG-3 agglutinated erythrocytes of guinea pig and cattle in a titer of 1: 8, as well as 1: 2 sheep and rabbit erythrocytes. Similar results were obtained in the hemadsorption reaction. All test strains of the virus diffusely adsorbed red blood cells of the above animals.

When studying the physicochemical properties of the LD-9 isolate, it was found that it, as well as the reference and vaccine strains of the PG-3 cattle virus, is sensitive to the effects of ether, chloroform, T +560 C, pH 5.0 and 3.0.