Изучение биологических взаимоотношений и биохимических свойств пробиотических микроорганизмов

Пандемия COVID-19 повысила внимание к питанию, связанному с иммунитетом. Большинство потребителей предпочитают продукты с доказанными лечебнопрофилактическими свойствами. Значительно возрос спрос на пробиотические молочные продукты из-за растущей осведомленности населения об их прямой связи с пользой для здоровья пищеварительной системы [1]. Здоровая микрофлора кишечника является одной из важнейших факторов благополучия человека [2–6]. В связи с этим производство пробиотических пищевых продуктов на основе наиболее значимых представителях микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека остается актуальным.

В 2015 г. на съезде Федерации европейских микробиологических обществ (FEMS) была выдвинута теория о создании и использовании для профилактики ряда болезней препаратов и продуктов, содержащих поликомпонентные пробиотические консорциумы [7]. Поиск штаммов пробиотических культур, способных активно развиваться при совместном культивировании, повышая свои биологические, пробиотические и технологические свойства, является актуальным и востребованным направлением микробиологии. Одной из основных причин низкой эффективности пробиотических продуктов питания на основе поликомпонентных микробных консорциумов является неэффективный подбор видового состава микроорганизмов без учета их биосовместимости, кинетики роста и биотехнологического потенциала каждого штамма. Это приводит к снижению количества живых клеток бактерий и утрате функциональных свойств [8].

Изучение биологических межштаммовых взаимодействий пробиотических культур является основой при подборе микроорганизмов для совместного культивирования. В литературе описаны механизмы антагонизма пробиотических бактерий как по отношению к патогенным и условно-патогенным микрооорганизмам, так и к представителям своего рода [8, 9]. В консорциуме бактерии выделяют различные продукты метаболизма и конкурируют как за субстрат, так и с микрофлорой желудочно-кишечного тракта человека [8, 9]. Опубликованы работы [8], в которых указывается, что биосовместимость культур в составе консорциумов влияет на уровень накоплении биомассы (на численность бактериальных клеток штаммов при совместном культивировании). В связи с этим подбор пробиотических культур в поликомпонентный консорциум должен проводится с учетом актуальных данных о биосовместимости штаммов, входящих в его состав.

Другим немаловажным аспектом является исследование биотехнологического потенциала каждого штамма, которого планируется включить в микробный консорциум. Среди важнейших характеристик можно выделить кислотообразующую способность, протеолитическую активностью, адгезивные свойства. Использование пробиотических культур с различной протеолитической активностью позволит получать ферментированные белки молока с различными биологически активными свойствами [10]. Оценка адгезивных способностей штаммов позволит сделать вывод об их способности прикрепляться к стенкам желудочно-кишечного тракта и более длительное время задерживаться в организме, проявляя свои пробиотические свойства [11]. При создании полиштаммовых заквасок необходимо учитывать кинетику роста каждого штамма консорциума, в том числе продолжительность экспоненциальной фазы роста. С помощью этих данных можно определить время инокуляции питательной среды в случае постепенного внесения монокультуры. Такой подход повышает биологические свойства консорциума [8].

Таким образом, на стадии подбора культур для создания комплексных полиштаммовых добавок с пробиотическими свойствами необходимо оценивать биосовместимость штаммов и их биотехнологический потенциал с целью повышения общей активности консорциума.

Цель исследований - изучить биологические межштаммовые взаимодействия пробиотических культур, а также протеолитическую активность и адгезивную способность штаммов, с перспективой создания новых эффективных консорциумов, которые можно использовать при получении заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов и биологически активных добавок.

Объекты и методы исследований

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: исследовать биологические межштаммовые взаимодействия пробиотических культур при совместном культивировании и отобрать сочетаемые штаммы; оценить биотехнологический потенциал культур и выявить штаммы с высокими протеолитическими и адгезивными свойствами; изучить кислотообразующую способность и динамику роста отобранных культур в монозаквасках и в микробном консорциуме для установления оптимальных условий культивирования.

Объектами исследований были 7 штаммов молочнокислых микроорганизмов: Lactobacillus paracasei к-406, Lactobacillus fermentum 44/1, Lactobacillus curvatus LCR-111-1, Lactobacillus rhamnosus 12L, Lactobacillus casei МДП-1, Lactobacillus plantarum 8РАЗ, Lactobacillus acidophilus 100АШ и 2 штамма бифидобактерии: Bifidobacterium breve DSM 20091, Bifidobacterium longum subsp. infantis, полученные из Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика.

Биосовместимость культур определяли методом прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) [8, 9, 12, 13]. Метод заключается в поочередном нанесении на поверхность питательной среды (MRS) двух капель тестируемых культур. Биосовместимость оценивали в месте наложения капель: если культуры полностью сливались – они считались совместимыми, если одна из культур росла поверх другой, подавляя ее рост, это расценивали как антагонизм [8, 13, 14].

Исследование уровня протеолитической активности внутриклеточных и внеклеточных ферментов у лактобактерий проводили с использованием желатина и протеолитической среды с молочным буфером [15]. Активность эндоферментов оценивали по характеру разжижения желатина в первый и последующие дни после внесения культур методом «укол в столбик». Внеклеточную экзоферментативную активность бактерий проверяли по размеру образовавшихся светлых участков (пептонизации белков молока) вокруг культур [15, 16].

Адгезивные свойства изучали согласно методики В.И. Брилиса на формализированных эритроцитах [17]. Результат оценивали по индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Микроорганизмы считаются неадгезивными при ИАМ≤1,75, низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными при ИАМ выше 4,0 [17].

Титруемую кислотность определяли методом титрования по ГОСТ 3624-92 [18]. Количество клеток лактобактерий и бифидобактерий определяли методом предельных разведений по ГОСТ Р 56139-2014 на соответствующих питательных средах (МRS-агар и ГМК-1) [19].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica 6. Использовали непараметрический критерий Манна - Уитни (для сравнения независимых выборок). Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р≤0,05.

Результаты и их обсуждение

При оценке характера межштаммовых взаимоотношений необходимо учитывать, что исследуемые культуры в процессе прироста бактериальной популяции способны продуцировать бактериоцины. Именно способность к выработке бактериоцинов определяет степень антагонистической активности штамма и обусловливает характер межбактериальных взаимодействий [9]. Данные о межвидовых взаимоотношениях исследуемых культур представлены в таблице 1.

Таблица 1

Межштаммовые взаимодействия лакто- и бифидобактерий при их совместном культивировании

Объект исследования

+      +     +    +     +     +     +      +

+      ±     -      +     +      +       +

+    +     +     +     ±      +

+     +     +     +      +

±     +     +      ±

+     +      +

+      +

+

Lactobacillus paracasei к-406

Lactobacillus fermentum 44/1

Lactobacillus curvatus LCR-111-1

Lactobacillus rhamnosus 12L

Lactobacillus casei МДП-1

Lactobacillus plantarum 8РАЗ

Lactobacillus acidophilus 100АШ Bifidobacterium breve DSM 20091

Продолжение таблицы 1

Объект исследования	<2 to 5 9 § 1 5 i § s.	81	^	^ 3 *3 ~	S 'S	si	2 s | 3	I S Q Co	В - S -S "§ ^ ^ §- i ■
Bifidobacterium longum subsp. infantis

Примечание: «+» - штаммы совместимы, «–» - штаммы несовместимы, «±» - наблюдается антагонизм («выход наверх» одной из культур)

Полученные результаты (см. табл. 1) показывают, что большинство исследуемых лакто- и бифидобактерий можно совместно культивировать в подобранных парах, а также получать многокомпонентные пробиотические консорциумы.

В паре Lactobacillus casei МДП-1 и Lactobacillus fermentum 44/1 наблюдалась сильная антагонистическая активность (см. табл. 1). Сильный антагонизм между этими бактериями ограничивает их применение для совместного культивирования. Умеренный антагонизм наблюдался в парах: Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactobacillus rhamnosus 12L; Lactobacillus casei МДП-1 и Lactobacillus plantarum 8РАЗ; Lactobacillus curvatus LCR-111-1 с Bifidobacterium breve DSM 20091, а также Lactobacillus casei МДП-1 и Bifidobacterium longum subsp. infantis. Внутриродовой антагонизм между Lactobacillus fermentum и Lactobacillus rhamnosus , а также Lactobacillus casei и Lactobacillus plantarum , возможно, объясняется более быстрым потреблением одной из культур питательных компонентов и «метаболическим давлением», связанным с негативным действием культуры антагониста на метаболизм другого штамма лактобактерий [20]. Антагонистическая активность лактобацил по отношению к бифидобактериям в исследуемых парах возможно объясняется тем, что в процессе жизнедеятельности лактобактерий в питательной среде MRS накапливают определенные экзометаболиты (бактериоцины), которые при данных условиях ингибирует рост Bifidobacterium breve и Bifidobacterium infantis . Штамм Lactobacillus casei МДП-1 показал самые слабые антагонистические свойства (его развитие при совместном культивировании подавлялось тремя другими штаммами). Данное обстоятельство ограничивает использование Lactobacillus casei МДП-1 в составе полиштаммовых микробных консорциумах из-за низкой устойчивости к действию бактерицидов родственных бактерий и возможной гибели этого микроорганизма.

Практический и научный интерес представляет изучение протеолитической активности пробиотических культур. Исследование уровня протеолитической активности начинали с изучения внутриклеточных и внеклеточных ферментов. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Внеклеточная и внутриклеточная протеолитическая активность разных штаммов пробиотических культур

Пробиотические штаммы	Протеолитическая активность (зоны просветления на среде, мм/форма разжижжения)
	внеклеточная (разложение молочного белка)	внутриклеточная (разжижение желатина)
Lactobacillus paracasei к-406	+++ (27±4 мм)	+++ (воронкообразное)
Lactobacillus fermentum 44/1	+++ (10±2 мм)	+++ (воронкообразное)
Lactobacillus curvatus LCR-111-1	+++ (15±3 мм)	+++ (воронкообразное)
Lactobacillus rhamnosus 12L	+++ (25±5 мм)	+++ (воронкообразное)

Продолжение таблицы 2

Пробиотические штаммы	Протеолитическая активность (зоны просветления на среде, мм/форма разжижжения)
	внеклеточная (разложение молочного белка)	внутриклеточная (разжижение желатина)
Lactobacillus casei МДП-1	+++ (25±2 мм)	+++ (воронкообразное)
Lactobacillus plantarum 8РАЗ	+++ (17±4 мм)	+++ (воронкообразное)
Lactobacillus acidophilus 100АШ	+++ (15±4 мм)	++- (воронкообразное)
Bifidobacterium breve DSM 20091	++‒ (6±1 мм)	-
Bifidobacterium longum subsp. infantis	+– – (3±1 мм)	-

Примечание: протеолитическая активность «+++» ‒ сильная зона (разложение молочного белка более 10 мм); «++–» ‒ средняя зона (разложение молочного белка 5–9 мм); «+– –» ‒ слабая (зона разложение молочного белка 1–4 мм); «– – –» ‒ отсутствует.

Из данных таблицы 2 видно, что исследуемые штаммы лактобактерий показали высокую протеолитическую активность внутриклеточных ферментов. Исследуемые штаммы лактобактерий разложили желатин в первые сутки культивирования, столбик разжижения имел форму воронки. Это указывает на то, что исследуемые культуры обладают большим количеством бактериальных протеиназ, связанных с клеточной стенкой. Именно благодаря этим внутриклеточным пептидазам олигопептиды посредством специфического пептидного транспорта будут поглощаться клеткой и гидролизоваться на короткоцепочечные пептиды и аминокислоты. Исследуемые штаммы бифидобактерий не разжижают желатин. Отсутствие желатиназы в исследуемых образцах указывает на то, что в данных культурах отсутствуют протеиназы, связанные с клеточной стенкой. Данный факт подтверждают литературные данные.

По способности пептонизировать молочный белок штаммы Lactobacillus paracasei к406, Lactobacillus casei МДП-1 и Lactobacillus rhamnosus показали более высокие показатели протеолиза (зона просветления составила 25–27 мм), у остальных штаммов Lactobacillus зоны просветления составили 10 - 17 мм, что также соответствует высокой протеолитической активности. Бифидобактерии уступают лактобактериям в этом эксперименте (см. табл. 2). По способности лизировать казеин штамм Bifidobacterium breve DSM 20091 показал более высокий показатель протеолиза: зона просветления составила 6 мм, что соответствует средней степени протеолитической активности. Штамм Bifidobacterium longum subsp. infantis проявил слабую протеолитическую активность (зона просветления казеина составила только 3 мм).

По совокупности результатов исследования протеолитической активности внутриклеточных и внеклеточных ферментов лактобактерий и бифидобактерий очевидна перспективность использования культур Lactobacillus для производства ферментированных кисломолочных продуктов.

Результаты исследований адгезивных свойств пробиотических культур представлены в таблице 3.

Таблица 3

Адгезивная способность пробиотических культур

Пробиотические штаммы	СПА	КУЭ, %	ИАМ	Адгезивные свойства
Lactobacillus paracasei к-406	2,8±0,06	85±0,3	3,3±0,02	среднеадгезивные
Lactobacillus fermentum 44/1	3,0±0,02	71±0,7	4,2±0,04	высокоадгезивные
Lactobacillus curvatus LCR-111-1	4,2±0,08	87±0,6	4,8±0,02	высокоадгезивные

Продолжение таблицы 3

Пробиотические штаммы	СПА	КУЭ, %	ИАМ	Адгезивные свойства
Lactobacillus rhamnosus 12L	3,1±0,04	89±0,2	3,5±0,06	среднеадгезивные
Lactobacillus casei МДП-1	3,3±0,01	92±0,1	3,6±0,01	среднеадгезивные
Lactobacillus plantarum 8РАЗ	4,1±0,02	89±0,3	4,6±0,05	высокоадгезивные
Lactobacillus acidophilus 100АШ	2,6±0,05	84±0,5	3,1±0,07	среднеадгезивные
Bifidobacterium breve DSM 20091	3,8±0,07	81±0,2	4,7±0,02	высокоадгезивные
Bifidobacterium longum subsp. infantis	4,0±0,02	95±0,2	4,2±0,01	высокоадгезивные

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о разной адгезивной способности пробиотических культур. Высокую степень адгезии проявили штаммы Lactobacillus curvatus LCR-111-1, Lactobacillus plantarum 8РАЗ и Bifidobacterium breve DSM 20091. Близкие по значению результаты показали Lactobacillus fermentum 44/1 и Bifidobacterium longum subsp. infantis . Остальные штаммы проявили среднюю степень адгезии.

По совокупности результатов исследования биосовместимости, протеолитической активности внутриклеточных и внеклеточных ферментов, а также адгезивной способности изучаемых штаммов пробиотических бактерий были отобраны следующие штаммы для составления консорциума: Lactobacillus curvatus LCR-111-1, Lactobacillus plantarum 8РАЗ, Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactobacillus paracasei к-406.

Для отобранных штаммов и поликомпонентного консорциума из выбранных культур проводилось изучение кислотообразующей способности и динамики роста на среде MRS (рис. 1, 2). Доза вносимой комбинированной закваски составляла 5 % от объема молока. Культивирование проводили при температуре 37 °С в течение 24 ч. Контролем служили результаты изучаемых показателей по каждой монокультуре.

Время, ч

• Lactobacillus curvatus

—*—Lactobacillus plantarum

—♦—Lactobacillus paracasei Lactobacillus fermentum

Рисунок 1 – Активность кислотообразования заквасок на основе различных культур Lactobacillus и их консорциума (разброс данных представлен стандартным отклонением для средних значений в трех независимых экспериментах)

Анализ результатов, представленных на рисунке 1, позволил сделать вывод о том, что лаг-фазы исследуемых культур практически совпадают (продолжаются первые 3–4 ч), в связи с этим полиштаммовый консорциум из выбранных культур можно составлять при одновременном смешивании четырех обобранных штаммов Lactobacillus в соотношении 1:1:1:1. Исследование показало, что в нарастание кислотности молока при добавлении микробного консорциума происходит значительно быстрее по сравнению с монокультурами. Уже через 10– 12 ч культивирования кислотность закваски, состоящей из консорциума лактобактерий достигает (120–130) ^°Т, тогда как в монокультурах такая кислотность наблюдалась через (14–20) ч. Это указывает на синергетический эффект между отобранными культурами. Наиболее высоким содержанием жизнеспособных клеток лактобактерий также наблюдалось в комбинированной закваске уже через 12 ч культивирования - 3×10⁹ КОЕ/см³ (рис. 2), тогда как в монозаквасках через этот же промежуток времени количество жизнеспособных клеток составляло порядка (10⁷–10⁸) КОЕ/см³.

■ Lactobacillus paracasei                 ■ Lactobacillus fermentum

■ Комбинированный консорциум

Рисунок 2 – Количественный учет Lactobacillus в монозаквасках и в микробном консорциуме (разброс данных представлен стандартным отклонением для средних значений в трех независимых экспериментах)

Таким образом, в результате проведённых исследований подобраны оптимальные условия культивирования консорциума из выбранных культур лактобактерий: соотношение культур - 1:1:1:1, температура культивирования - 37^°С, продолжительность - 12 ч. При выбранных условиях наблюдаются сбалансированный рост пробиотических микроорганизмов и установление симбиотических отношений между ними.

Заключение

Результаты исследований подтвердили, что для повышения биологических и технологических свойств полиштаммовых консорциумов необходимо учитывать биологическую совместимость входящих в консорциум штаммов и их биотехнологический потенциал. Полученные результаты коррелируют с данными, представленными другими исследователями [8, 9, 12–14]. Тщательный скрининг пробиотических штаммов на предмет их биологической и технологической пригодности позволяет отобрать штаммы с наилучшими производственными, функциональными и технологическими характеристиками.

В результате проведенных исследований были изучены биологические межштаммо-вые взаимодействия пробиотических культур вида Lactobacillus и Bifidobacterium , определены их протеолитическая активность и адгезивная способность с целью создания эффективного полиштаммового консорциума. На основе проведенных экспериментов были отобраны следующие пробиотические штаммы для составления консорциума: Lactobacillus curvatus LCR-111-1, Lactobacillus plantarum 8РАЗ, Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactobacillus paracasei к-406. Отмечено, что взаимоотношения отобранных пробиотических бактерий относятся к синергид-ным. При совместном культивировании выбранных культур на питательной среде «капельным методом» наблюдалось полное слияние «капель», что соответствует высокому уровню биосовместимости. Высокий уровень биосовместимости, протеолитической и адгезивной активности отобранных штаммов определил целесообразность их использования в составе закваски для совместного культивирования. Lactobacillus curvatus LCR-111-1, Lactobacillus plantarum 8РАЗ, Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactobacillus paracasei к-406 имеют одну оптимальную температуру культивирования (37 ^°С), схожую динамику роста и высокую устойчивость к действию бактериоцинов друг друга. Совместное культивирование отобранных штаммов приводит к сокращению ферментационного цикла и количественному увеличению жизнеспособных клеток Lactobacillus по сравнению с монозаквасками. Проявление синергизма пробиотическими культурами, их высокая протеолитическая и адгезивная активность делают возможным рекомендовать подобранный консорциум для применения в функциональных продуктах питания и пробиотических биологически активных добавках.

Научно-исследовательская работа проведена за счет средств гранта «Молодые ученые ВСГУТУ - 2022» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления».