Изучение ферментов малат-аспартатной челночной системы у генотипов пшеницы

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.1                                           

В глобализированном мире быстрый рост населения, сокращение биоразнообразия и ограниченность пригодных и продуктивных земельных площадей для сельского хозяйства представляют серьезную угрозу удовлетворению потребностей населения в продуктах питания [1]. В связи с этим, засуха, являющийся одним из абиотических стрессовых факторов, способных прямо или косвенно влиять на метаболизм растений, остается активной темой дискуссий в исследованиях, проводимых в этой области в последние десятилетия [2, 3]. Ферменты аспартатаминотрансфераза (АспАТ/АСАТ/ААТ, КФ 2.6.1.1) и НАДмалатдегидрогеназа (L-малат-НАД-оксидоредуктаза, НАД-МДГ, КФ 1.1.1.37) обеспечивают связь между углеводным обменом и метаболизмом аминокислот, играя важную роль как в процессах катаболизма, так и амаболизма. Фермент малатдегидрогеназа, катализирующий взаимное превращение малата и оксалоацетата, обнаружен во всех живых организмах и субклеточных органеллах (митохондриях, глиоксисомах, пероксисомах, хлоропластах) [4]. АспАТ обеспечивает транспорт α-аминных групп между аспартатом и глутаматом. Он катализирует обратимую реакцию превращения аспартата и α-кетоглутарата в оксалоацетат и L-глутамат. Аспартат является промежуточным метаболитом аминокислотного обмена и цикла Кребса. Аспартат, как промежуточный метаболит, участвует в росте и развитии растений, в формировании механизма стрессоустойчивости [5–11]. Основная роль аспартата в эукариотических клетках заключается в транспортировке синтезируемых в результате гликолиза восстановительных эквивалентов через мембрану митохондрий и обеспечении участия в генерации АТФ [12]. Аспартат, синтезированный в митохондриях, транспортируется в цитозоль с помощью специальных транспортеров. Аспартат в цитозоле снова превращается в малат под воздействием АспАТ и MДГ, в результате чего соотношение НАД+/НАДН увеличивается [12, 13]. Соотношение NAD+/NADH объединяет многие аспекты метаболизма и играет важную роль в процессах развития растений и реакции на стресс. Целью исследования являлась изучение роли ферментов малат-аспартатного шаттла (АспАТ и НАД-МДГ) [15] в повышении продуктивности пшеницы [14], которая составляет 18–20% пищевого белка человека.

Материалы и методы исследования

Для исследования были отобраны четыре генотипа пшеницы хранящихся в генофонде НИИСХ Минсельхоза: Муров 2, Аран, Гызыл Бугда, Зирва.

Генотипы мягкой пшеницы выращивались в лаборатории с искусственным климатом при световом периоде 16/8 ч и температуре 24°C/18°C, режиме день/ночь соответственно, и относительной влажности 50%. 14-дневные проростки были подвергнуты стрессу засухи. Измерения проводились в двух вариантах 10 биологических и 3 технических повторностях.

Для определения ферментативной активности листья промывали дистиллированной водой, сушили на фильтровальной бумаге и размельчали в течении 3 минут в ступке, используя 100 мМ Tris-HCl (pH 7,8) буфер содержащий 5 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl 2 ×6H 2 O, 1 мМ ЭДТА×4Na, 0,5% Тритон Х-100 и 1% PVP. После фильтрации полученного гомогената, фильтрат сначала центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут, а затем при 5000 g в течение 30 минут. Этот процесс проводили при температуре +4°С. Надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов.

Активность НАД-МДГ определяли спектрофотометрическим методом (Ultrospec 3300 pro, Amersham, USA) [16]. Реакционная среда состояла из 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0) буфера содержащий 1 мМ оксалоацетат, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА), 10 мМ MgCl 2 , 0,15 мкМ НАДН и 5–10 мкл ферментативный препарат. Реакцию инициировали добавлением в среду 1 мМ оксалоацетата. Среда для прямой реакции состояла из 100 мМ

Трис-HCl (рН 9,0), 30 мМ малата, 0,2 мМ НАД. Измерения проводили в спектрофотометрических кюветах объемом 1,0 мл. Количество НАДН определяли по снижению оптической плотности молярной концентрации этого соединения при длине волны 340 нм в течение 1 минуты. Реакционная среда для определения активности аспартатаминотрансферазы состояла из 100 мМ HEPES-KOH (рН 7,4) и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 2 мМ ЭДТА, 2,5 мМ 2-оксоглутарата, 10 мкг/мл пиродоксальфосфата, 10 мМ ДТТ, 12 ЕД/мл МДГ и 0,2 мМ НАДН. Реакцию инициировали добавлением в среду 20 мкл экстракта листьев и 2,5 мМ L-аспартата [17].

Общее количество растворимого белка определяли с помощью 0,12% раствора Кумасси бриллиантового синего G-250. Измерения оптической плотности проводили на спектрофотометре (Ultrospec 3300 pro, Amersham) при длине волны 610 нм. Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин [18].

Все эксперименты были выполнены в 3-x повторностях и погрешности определяли с использованием программы статистического анализа Student’s t-test. Различия между средними значениями считались достоверными при значениях Р <0,01, 0,005.

Результаты и обсуждение

Активность НАД-малатдегидрогеназы определяли в листьях сортов мягкой пшеницы, выращенных в условиях искусственного климата. Активность НАД-МДГ в листьях сорта Зирва увеличивалась в 1,5 раз при стрессе (17,38±2,0 мкмоль ОА/белок мин-1) по сравнению с образцами выращенными при нормальном поливе (11,4±1,2 мкмоль ОА/белок мин-1).

Активность фермента НАД-МДГ у сортов Аран и Муров-2 была близка к сорту Зирва 85

Рисунок 1. Изменение активности НАД-малатдегидрогеназы в листьях сортов мягкой пшеницы, выращенных в условиях искусственного климата

В отличие от других сортов, в листьях сорта Гызыл бугда, активность фермента НАД-МДГ уменьшалась в 1,2 раза (17,6±1,8 мкмоль ОА/белок мин-1) в стрессовых условиях по сравнению с образцами (15,0±1,45 мкмоль ОА/белок мин-1) выращенными при нормальном поливе. Наибольшая фермента НАД-МДГ наблюдалась в листьях сорта Аран (18,08±2,0 мкмоль ОА/белок мин-1) подвергнутого стрессу. Малат участвует во многих физиологических процессах, таких как обеспечение НАДН для реакции восстановления нитратов, биосинтез жирных кислот для углеродной цепи и фотодыхания, движение устьиц посредством регуляции осмотического давления, контроль клеточного рН, окислительновосстановительный гемостаз, а также транспорт и обмен восстановленных эквивалентов между клеточными компартментами. Синтез малата является результатом последовательного действия ФЕПК и МДГ. В данной работе изучали активность фермента аспартатаминотрансферазы во флаговых листьях сортов пшеницы (Рисунок 2).

Щ и я 2

Рисунок 2. Изменение активности фермента аспартатаминотрансферазы в листьях сортов мягкой пшеницы, выращенных в условиях искусственного климата

Активность фермента АспАТ была выше в стрессовых вариантах всех изученных сортов пшеницы по сравнению с растениями выращенными при нормальном поливе. Активность фермента АспАТ повышалась в 2 раза в образцах листьев сорта Зирва в стрессовых условиях (0,116±0,02 мкмоль мг-1×белок·мин-1) по сравнению с поливом (0,059±0,007 мкмоль мг-1×белок·мин-1). Среди изученных сортов мягкой пшеницы самый высокий показатель был обнаружен у сорта Зирва выращенного в условиях засухи. Активность фермента в сорте Аран при засухе (0,056±0,007 мкмоль·мг-1×белок·мин-1) незначительно превышала значение, полученное для контрольных растений (0,054±0,008 мкмоль мг-1×белок·мин-1). Активность фермента АспАТ в контрольных и опытных вариантах составляла, соответственно, 0,088±0,01 мкмоль мг-1×белок мин-1 и 0,105±0,001 мкмоль мг-1×белок мин-1. У этого сорта активность фермента АспАТ в опытном варианте в два раза превышала значение контрольного варианта. Активность фермента АспАТ была в 2,3 раза выше у растений сорта Муров-2 (0,091±0,001 мкмоль мг-1×белка мин-1) при засухе по сравнению с растениями контрольного варианта (0,039 мкмоль мг-1×белка мин×1). Наибольшее соотношение между вариантами отмечено у сорта Муров-2. В результате изучения ферментов (АспАТ и НАД-МДГ) малат-аспартатного шаттла, играющих важную роль в повышении продуктивности растений пшеницы, установлено, что активность обоих ферментов у засухоустойчивых генотипов выше по сравнению с неустойчивыми генотипами. AspAT и НАД-МДГ НАД+/НАДН играют важную роль в процессах развития растений и реакции на стресс.

Заключение

Согласно полученным результатам, исследованные ферменты малат-аспартатного шаттла играют важную роль в адаптационных процессах высших растений — распределении углерода и энергии.