Изучение контаминации микотоксинами виноградного вина, потребляемого в Российской Федерации

Виноград относится к наиболее любимым и потребляемым ягодам на территории России. Грибковые заболевания, вызванные Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Greeneria uvicola, Glomerella cingulata , а также видами Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Rhizopus, Colletotrichum и Phomopsis , снижают урожайность и качество винограда [1]. Среди грибов, вызывающих заболевания винограда, есть нитчатые грибы видов Alternaria, Aspergillus и Penicillium , способные продуцировать токсичные вторичные метаболиты – микотоксины

(МТ). Имеются сведения о выявлении в винограде альтернариола (AOH), афлатоксинов (AFL), монометилового эфира альтернариола (АМЕ), тенуазоно-вой кислоты (ТеА), фумонизинов В1 и B2 (FB1 и FB2), патулина (PAT), пенициловой кислоты (РА), циклопиазоновой кислоты (CPA), зеараленона (ZEN), цитринина (CIT) и охратоксина A (OTA) [2–5]. Их токсическое действие связано с нефротоксичностью, гепатотоксичностью, цитотоксичностью, тератогенностью и иммунотоксичностью [6]. В связи с высокой токсичностью МТ и возможным рис-

Седова Ирина Борисовна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-65; ORCID: .

Чалый Захар Андреевич – младший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-65; ORCID: .

Тутельян Виктор Александрович – академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель (e-mail: ; тел. 8 (495) 698-53-46; ORCID:

ком для здоровья населения проводятся многочисленные исследования на предмет их наличия в сырье и пищевых продуктах.

ОТА является наиболее изученным из МТ в виноградной продукции и может представлять реальную проблему для промышленности. Согласно оценкам Комиссии «Кодекс Алиментариус», вино является вторым пищевым продуктом после зерновых с наибольшим вкладом в ежедневное поступление ОТА (до 15 %) [7]. Контаминация OTA может произойти на любом этапе процесса виноделия: начиная от колонизации винограда микотоксигенными грибами, заканчивая процессом упаковки вина. Однако основное загрязнение готового продукта происходит в результате переноса микотоксинов из винограда [8]. Кроме того, процесс виноделия сильно влияет на содержание ОТА, так как в красных винах отмечаются более высокие концентрации, чем в розовых и белых винах [9].

Имеются сведения о выявлении этого токсина в вине за последние 20 лет в различных странах мира: в России (до 0,64 мкг/л) [10], США (до 8,6 мкг/л) [11], Европе: Греции (до 0,212 и 2,52 мкг/л) [12, 13], Дании (до 0,6 мкг/кг) [14], Испании (до 0,104 и 0,142 мкг/л) [12, 15], Италии (до 0,286; 1,56; 2,28 мкг/л) [12, 16, 17], Португалии (до 1,18 мкг/л) [18], Сербии (до 0,134 мкг/л) [19], Франции (до 0,088 мкг/л) [12], Хорватии (до 0,061 и 0,24 мкг/л) [2, 12], Аргентине (до 0,98 мкг/л) [20], Бразилии (до 0,62 мкг/л) [21], Израиле (до 0,065 мкг/л) [12], Китае (до 0,98 и 1,27 мкг/л) [3, 22], Таиланде (до 1,72 мкг/л) [23], Турции (до 0,101 мкг/л) [12], Южной Африке (до 0,455 мкг/л) [12].

Гигиенические регламенты содержания МТ в виноградном вине в настоящее время отсутствуют в РФ. При этом в некоторых странах мира введены ограничения содержания ОТА: в странах ЕС1 и Корее – на уровне 2 нг/г, в Бразилии – 10 нг/г [24].

Для объективной оценки контаминации виноградных вин малоизученными токсинами микроми-цетов в перечень анализируемых МТ были включены 12 видов эмерджентных МТ (ЭМТ), источниками которых могут быть как представители Fusarium sp., Aspergillus sp., Аlternaria sp., Penicillium sp., так и грибы других родов.

В связи с изложенным цель исследования – изучение частоты и уровней контаминации широким спектром МТ виноградных вин, реализуемых в России. В продуктах определяли содержание 27 МТ, включая регламентируемые в пищевых продуктах растительного происхождения, их производные, структурные аналоги и ЭМТ.

Материалы и методы. Образцы виноградного вина были приобретены в торговой сети Москвы и

Московской области в 2020 г. Всего было исследовано 36 образцов, которые включали 21 пробу красного вина, 12 – белого, 3 – розового вина. Производителями вина были Россия, включая республики Крым и Дагестан, а также Грузия, Чили, Италия, Франция, Новая Зеландия, Аргентина, Испания, Австрия и Израиль.

Отбор проб продовольственного сырья и пищевых продуктов на анализ проводился в соответствии с ГОСТ 33303-2015 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для определения микотоксинов»2.

Во всех исследованных образцах определяли содержание МТ, продуцируемых грибами родов Penicillium и Aspergillus : OTA, AFL B1, B2, G1, G2, PAT, STC, CIT, PA, MPA, рода Alternaria : АОН, АМE, ALT, TEN и TeA, рода Fusarium : DON, FB1, FB2, токсины T-2, HT-2, ZEN, β-зеараленол (β-ЗЕЛ), ниваленол (NIV), монилиформин (МО), боверицин (BEA), энниатины А и В (ENN А и В). Среди изученных МТ CIT, STC, MPA, МО, ENN А, ENN В, BEA, ТЕN, ТеА, АОН, АМE и ALT являлись эмерд-жентными МТ (ЭМТ).

Подготовка проб вина. За основу была взята методика [14] с минимальной модификацией. Из представительной пробы объемом не менее 100 см³ в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ отбирали 5 ± 0,02 г вина, добавляли 5 г воды, затем 10 см³ ацетонитрила, содержащего 1 % уксусной кислоты, перемешивали в течение 1 мин при 300 об./мин. В пробирку вносили 3 г безводного сульфата магния, немедленно перемешивали в течение 1 мин, 3 см³ аликвоты ацетонитрильного экстракта (верхний слой) переносили в другую центрифужную пробирку, содержащую 450 мг безводного сульфата магния, тщательно перемешивали механически в течение 1 мин. Пробирку центрифугировали при 4000 об./мин при 10 °С в течение 4 мин. К аликвоте экстракта объемом 0,5 см³ добавляли 0,5 см³ метанола. Полученный раствор использовали для количественного анализа. Пробы готовили для анализа в двух повторностях.

Анализ образцов продуктов переработки винограда на наличие МТ проводили с использованием ВЭЖХ системы Waters Acquity H-plus HPLC, соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с подогреваемым источником (XEVO TQ-XS), контролируемым программным обеспечением MassLynx V4.2 (Waters Corporation, США). Температура в автосамплере – 4 ºС. Разделение анали-тов осуществляли на колонке, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (Zorbax SB-С18, 150 × 4,6 мм, 3,5 мкм, Agilent). Температура колонки в термостате – 30 ºС. Скорость потока элюента – 0,5 мм3/мин. Объем вносимой пробы составил 10 мм3.

Градиентное элюирование было применено для разделения токсинов: фаза А – вода: метанол (95: 5 об. %); фаза Б – метанол: вода (95: 5 об. %), обе фазы модифицированы 10 мМ ацетатом аммония. Схема градиентного элюирования в условиях отрицательной полярности ионизации: от 0 до 1 мин – 0 % Б, от 1 до 7 мин – линейное увеличение Б от 0 до 70 %, от 7 до 15 мин – линейное увеличение Б от 70 до 100 %, от 15 до 19 мин – постоянно 100 % Б, от 19 до 19,5 мин – линейное снижение Б до 0 %, от 19,5 до 22 мин – уравновешивание системы при 0 % Б. Схема градиентного элюирования в условиях положительной полярности ионизации: от 0 до 7 мин – линейное увеличение Б от 10 до 75 %, от 7 до 17 мин – линейное увеличение Б от 75 до 100 %, от 17 до 19 мин – постоянно 100 % Б, от 19 до 19,5 мин – линейное снижение Б от 100 до 10 %, от 19,5 до 24 мин – уравновешивание системы при 10 % Б. МС/МС детектирование осуществляли в режиме электроспрея в динамическом режиме MRM в условиях положительной и отрицательной ионизации.

Параметры источника: ионная ловушка с ионизацией электроспреем; капиллярное напряжение – 0,5 кВ, напряжение конуса – 3 В, температура источника – 500 ºС; температура десольватации – 500 ºС; поток газа в конусе – 150 дм3/ч, поток газа десольватации – 1000 дм3/ч, поток газа для соударения – 0,15 см3/мин, давление небулайзера – 7 бар.

Стандартные растворы смесей МТ готовили из сухих стандартов (Sigma-Aldrich; Fermentek, Jerusalem, Israel). Стандартные растворы хранения AFL, STC, CIT, PA, PAT, трихотецены групп A и B, ZEN и аналоги, OTA готовили в ацетонитриле, стандартные растворы хранения токсинов Alternaria , ENN А, ENN В, BEA, MPA, МО – в метаноле, FB1, FB2 – в смеси «ацетонитрил / вода» – 50 / 50 (% об.), с концентрацией 100 или 500 мкг/см³. Из стандартных растворов готовили мультистандарты и калибровочные растворы. Все растворы хранились при температуре минус 18 °C.

Статистическая обработка данных. Статистически обработанные данные по содержанию

МТ в исследованных пробах представляли в виде М – среднего арифметического среди проб всего ряда и М _конт – среднего арифметического среди загрязненных проб соответственно; и 95%-ного персентиля. При расчете среднего уровня контаминации образцов в пробах всего ряда содержание МТ в пробах, загрязненных на уровне ниже предела количественного определения метода, принимали за «ноль».

Для количественного определения МТ в виноградном вине использовали внешние градуировки на «чистой» матрице. Пределы количественного определения МТ (ПКО), рассчитанные по 10-σ критериям, для образцов (в мкг/кг) составили для STC – 0,25, ОТА – 0,30, AFL B1, Т-2, MPA, TEN – 0,40, AFL B2, G1, G2, HT-2, AME, ALT – 1,00, BEA, ENN A, ENN B – 1,50, AOH, РА – 2,00, CIT – 3,00, FB1, ZEN – 4,0, PAT, β-ZEL – 6,00, DON, NIV – 20,00, FB2 – 25,0, МО – 30,00, ТеА – 40,00.

Результаты и их обсуждение. Изучение загрязненности МТ виноградных вин показало наличие 10 из 27 анализируемых МТ в 11 (31 %) из 36 изученных образцов (табл. 1). В целом выявлены относительно низкие частота и уровни контаминации токсинами этих напитков.

В 4 образцах был обнаружен AFL G2 в количестве от 1,01 до 3,05 мкг/кг. Несколько реже, в 8 % случаев, находили ALT и MPA. В двух их 36 изученных образцов вина были выявлены TEN, FB1 и STC в количестве до 0,84, 27 и 1,70 мкг/кг соответственно. В единичных образцах обнаруживали токсины НТ-2 (1,18 мкг/кг), ОТА (0,39 мкг/кг), ZEN (5,08 мкг/кг) и TeA (146,5 мкг/кг). Содержание ОТА не превышало величин гигиенических регламентов, установленных в этом виде продукции.

О случаях выявления в образцах виноградного вина AFL в более низких концентрациях и ОТА было сообщено в [16]. В этом исследовании от 10 до 13 % образцов были загрязнены AFL В1, B2, G1, G2 в количестве до 0,035, 0,016, 0,068 и 0,033 мкг/дм3 соответственно; около 97 % изученных проб содержали ОТА – от 0,021 до 1,56 мкг/дм3.

Таблица 1

Содержание микотоксинов в образцах виноградного вина, n = 36

Микотоксин	Кол-во проб, содержащих токсины		Содержание токсинов в контам. пробах, мкг/кг		Содержание токсинов в пробах всего ряда, мкг/кг
	абс.	%	диапазон	M конт	М	90 %
AFL G2	4	11	1,01–3,05	1,74	0,19	0,50
ALT	3	8	1,35–2,98	1,90	0,16	0
MPA	3	8	3,54–5,51	4,37	0,36	0
TEN	2	6	0,65–0,84	1,74	0,04	0
FВ1	2	6	26,40–27,04	26,72	0,19	0
STC	2	6	0,37–1,70	1,04	0,06	0
НТ-2	1	3	1,18	1,18	0,03	0
ZEN	1	3	5,08	5,08	0,14	0
TeA	1	3	146,5	146,5	4,07	0
OTA	1	3	0,39	0,39	0,01	0

Рис. 1. Частота загрязнения токсинами красного ( n = 21) и белого ( n = 12) вина

Рис. 2. Частота и уровни загрязнения микотоксинами образцов вина различного происхождения (содержание МТ указано в мкг/кг)

О выявлении альтернариатоксинов в пробах вина также сообщали [14, 17, 23, 25]. В исследовании [25] были найдены МТ TeA и TEN, однако частота загрязнения ими были значительно выше, чем по результатам наших данных. О выявлении AOH и AME в более чем половине изученных образцов сообщали [17, 25] и о единичном случае – АМЕ [23], однако ALT в исследованных ими образцах вина выявлен не был.

Имеются сведения об обнаружении в вине фумонизинов [23], НТ-2 [17], ZEN и MPA [3, 14].

В зависимости от классификации по цвету изученные образцы виноградного вина были разделены на три группы: красное – 21 образец, белое – 12, и розовое – 3. Ни в одном из трех образцов розового вина МТ не были обнаружены. В пробах красного вина были найдены 10 токсинов (рис. 1), тогда как в пробах белого вина – 4 МТ: FB1, MPA, STC и ZEN.

Наиболее часто в образцах красного вина, в 19 % случаев, обнаруживали AFL G2. В 14 % образцов выявляли FВ1 и AFL, в 10 % – TEN и MPA. Остальные токсины были найдены в единичных случаях. Следует обратить внимание, что ОТА был выявлен только в образце красного вина. При производстве красного вина его могут выдерживать в течение нескольких дней при повышенной температуре в аэробных условиях без фильтрации, что, в свою очередь, может способствовать накоплению токсина в нем, при этом при изготовлении белого вина после отжима сок винограда сразу фильтруют и подвергают ферментации [10].

По сравнению с красным вином, спектр обнаруживаемых токсинов в белом был более незначительным. Частота его контаминации FВ1 была ниже, чем в красном вине: 8 против 14 % соответственно. Кроме того, в образцах белого вина были найдены MPA, STC и ZEN, частота их обнаружения варьировалась от 4 до 10 %.

Только в отечественном вине были выявлены TeA и НТ-2 (рис. 2). Как в образцах отечественного, так и импортного вина были найдены MPA, AFL G2 и TEN, причем частота их обнаружения в отечественном вине была в несколько раз выше. Следует отметить, что только в вине, полученном по импорту, были найдены FВ1, ZEN, STC, ALT и ОТА.

Следует отметить, что в 3 образцах красного и одном образце белого вина была выявлена одновременная контаминация несколькими токсинами. Перечень загрязненных вин с указанием сорта и происхождения и обнаруженных МТ приведен в табл. 2. В образце сухого белого вина, произведенного в Италии, были обнаружены токсины STC и ZEN. В пробах сухого красного вина из Испании были найдены AFL G2 и ALT; из России – 4 токсина (AFL G2, TEN, НТ-2 и MPA). Образец красного десертного вина из Израиля был загрязнен четырьмя токсинами ОТА, STC, MPA и ALT. В двух образцах вина обнаружили по 2 МТ (STC+ZEN и ALT+AFL G2); по одному образцу содержали 4 МТ (ALT+MPA+ОТА+STC) и 5 МТ (TEN+AFL G2+НТ-2+MPA+TeA).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии ОТА, AFL, FВ1, STC в виноградных винах, представленных на территории России, что предполагает установление соответствующего контроля со стороны производителей и надзорных органов, в частности, за содержанием ОТА.

По данным Единой межведомственной информационно-статистической системы (ЕМИСС), ФТС, Федерального центра развития экспорта продукции АПК Минсельхоза России, Федеральной службы по регулированию алкогольного рынка [26], потребление вина на душу населения с 2018 по 2020 г. варьировалось от 6700 до 7400 cм3 на человека в год. В 2020 г. оно составило 6700 см3. Данные последних лет (2022) свидетельствуют, что больше вина потребляется в Ненецком автономном округе, Карелии, Московской области и Санкт-Петербурге (от 10 200 до 11 700 см3 на человека), а наименьшее количество – на Северном Кавказе (от 20 до 700 см3 на человека)3.

Таблица 2

Частота и уровни загрязнения МТ образцов вина в зависимости от их происхождения

№ п/п	По содержанию сахара	Страна-производитель	Токсин (содержание в мкг/кг)
Красное вино
1	Десертное	Израиль	ОТА (0,39) + STC (1,70) + MPA (3,54) + ALT (1,35)
2	Десертное	Кипр	FВ1 (26,4)
3	Сухое	Грузия	TEN (0,65)
4	Сухое	Испания	AFL G2 (1,01) + ALT (2,98)
5	Сухое	Аргентина	AFL G2 (3,05)
6	Сухое	Россия	AFL G2 (1,59) + TEN (0,84) + НТ-2 (1,18) + MPA (5,51) + TeA (146,5)
7	Сухое	Чили	ALT (1,36)
8	Полусладкое	Россия	AFL G2 (1,32)
Белое вино
9	Сухое	Новая Зеландия	FВ1 (27,04)
10	Сухое	Италия	STC (0,37) + ZEN (5,08)
11	Полусладкое	Россия	MPA (4,07)

Принимая во внимание данные о среднем потреблении вина населением России, среднем и максимальном содержании в них выявленных токсинов (см. табл. 2), была рассчитана вероятная нагрузка ими на население. В качестве референтных значений для МТ ZEN, FB1+FВ2 были взяты величины условнопереносимого суточного поступления (УПСП), установленные Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA): 500 нг/кг массы тела (м.т.) для ZEN и его метаболитов [27]; 2000 нг/кг м.т. для суммы фумонизинов [28]; переносимое суточное поступление для токсинов DAS, Т-2 и НТ-2 отдельно или в комбинации на уровне 25 нг/кг м.т. в сутки [29], и условно-переносимого недельного поступления (УПНП) – 112 нг/мг м.т. для ОТА [30]. В качестве ориентировочных референтных значений для AFL использовали величины среднего и высокого, соответствующего 95-му персентилю, хронического поступления AFL B1 для населения в возрасте старше 18 лет [31]; для альтернариатоксинов – порог токсического воздействия (ТТС), рассчитанный по данным Европейского агентства по безопасности пищи (EFSA): ТТС АОН и АМЕ – по 2,5 нг/кг м.т./сут, для ТЕN и TeA – 1500 нг/кг м.т./сут [32], для ALT – 1500 нг/кг м.т./сут [33]; для STC – поступление, оказывающее незначительное влияние на здоровье человека, – 16 нг/кг м.т./сут [34]. Средняя масса тела человека была принята за 70 кг.

Среднее расчетное поступление токсинов на население России в неделю варьировалось от 0,07 нг/кг м.т. (0,0007 %) для TEN до 0,35 нг/кг м.т. (22,7–27,7 %) для AFL G2; при этом для ОТА – 0,019 нг/кг м.т. (0,02 % от УПНП). Максимальное расчетное поступление ZEN, FB1, OTA, HT-2, аль-тернариатоксинов и STC составило относительно референтных значений 0,27; 0,36; 0,64; 1,25; 2,6 и 2,82 % соответственно. Наиболее высокие вероятные поступления МТ были связаны с потреблением виноградного вина, загрязненного AFL G2 на уровне 90 % загрязнения (0,50 мкг/кг) и на максимальном уровне (3,05 мкг/кг). В этом случае нагрузка могла достигать за неделю 0,91 нг/кг м.т. (от 9,6 до 31 % от референтного значения) и 5,6 нг/кг м.т. (58,8–190,5 % от референтного значения) соответственно. При этом для жителей Ненецкого автономного округа, Карелии, Московской области и Санкт-Петербурга расчетная нагрузка AFL G2 может превышать эти значения в 1,5–1,75 раза.

Полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о незначительном поступлении альтернариатоксинов, STC, FB1, HT-2 и OTA и более высокой нагрузке АFL G2 при потреблении виноградного вина, остается потенциальная опасность их хронического поступления в организм человека.

Выводы:

• 1.    Установлено загрязнение микотоксинами 31 % образцов виноградных вин преимущественно афлатоксином G2, альтенуеном, микофеноловой кислотой, фумонизином B1 и стеригматоцистином. Среди регламентируемых токсинов в иностранных винах выявлены охратоксин А, афлатоксин G2, фумонизин В1, зеараленон и стеригматоцистин; в отечественных – афлатоксин G2.

• 2.    Величина расчетного поступления микотоксинов с вином свидетельствует о низком релевантном риске (до 2,8 % от величин референтных значений) для здоровья населения России, исключение составляют афлатоксин G2, среднее поступление с вином может достигать 28 %.

• 3.    Реальной угрозы для населения РФ виноградное вино как источник микотоксинов не представляет. Однако выявление высоких уровней AFL G2 в образцах виноградного вина предполагает установление соответствующего контроля со стороны производителей и надзорных органов за содержанием этого токсина и регламентируемого в странах ЕС ОТА.

Финансирование. Работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках темы FGMF-2022-0003.