Изучение онкоспецифических маркеров и некоторых биохимических показателей в меланоцитарных образованиях кожи

Введение. В последние годы меланому относят к важнейшим проблемам общественного здравоохранения. Рост заболеваемости наблюдается во всем мире, в 2017 г. диагностировано 87 110 новых случаев инвазивной меланомы и 9730 случаев смертей от нее [1]. По данным российской статистики, злокачественные новообразования кожи занимают первое место в структуре общей (оба пола) онкологической заболеваемости: в 2016 г. их доля с учетом меланомы составила 14,2 %, без меланомы – 12,5 %. При этом прирост заболеваемости меланомой в России за послед- ние 5 лет достиг 20 %. В 2016 г. выявлено 10 454 новых случая меланомы, в то время как в 2012 г. – 8723 [2]. Удельный вес больных c III–IV стадиями превышает 30 %. Меланома характеризуется агрессивным течением, средняя 5-летняя выживаемость на поздних стадиях развития опухоли составляет 18 %, а медиана продолжительности жизни – 7,8 мес. Считается, что развитие этой опухоли является главной причиной смерти больных c онкопaтологиeй кожи [3].

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению патогенеза ме- ланомы, продолжают существовать трудности диагностики, классификации, прогностической оценки развития опухоли и выбора методов адекватного лечения. В связи с высоким метастатическим потенциалом меланомы и необходимостью длительного мониторинга пациентов до сих пор не обнаружено высокочувствительного и высокоспецифического маркера меланомы кожи.

На сегодняшний день в качестве онкомаркеров различных опухолей используют белки семейства S100, CD44, TA-90 и ряд других показателей. Однако большинство из них не информативны на ранних стадиях заболевания и могут быть использованы в качестве критериев прогрессирования опухолевого процесса только после выявления метастазов. Повышенный интерес вызывают белки S100 – группа кальций-связывающих белков с низкой молекулярной массой (10–12 кДа). Показана роль S100 в патогенезе и метастазировании рака, микроокружении опухоли, обсуждается перспективность их использования в качестве биомаркеров и прогностических факторов в онкологии [4]. В последние годы белки семейства S100 рассматриваются в качестве достаточно универсальных онкомаркеров, экспрессия которых характерна для раков различной локализации [5–8]. Однако сведений об исследовании новых, недавно идентифицированных белков семейства S100 у больных меланомой нам найти не удалось. Показано увеличение уровня S100A6 у больных меланомой при T2 и отсутствие накопления этого белка при других стадиях процесса [9].

На данный момент наиболее изученным биомаркером меланомы является белок S100B, представляющий собой димер с молекулярной массой 20 кДа, который состоит из двух мономеров – S100A1 и S100B. Он используется при патоморфологической диагностике меланомы в качестве стандартного иммуногистохимического маркера. Белок S100B выделяется злокачественными меланоцитами в кровь, где также может быть измерен. Следует отметить, что белок S100В не является специфическим для меланомы маркером. Этот протеин синтезируется также в нервных клетках головного и спинного мозга, в скелетных мышцах, фагоцитах. Его повышение отмечается при различных воспалительных и инфекционных заболеваниях, опухолях почек и некоторых разновидностях лейкозов, а также при заболеваниях почек и печени (в т.ч. метастазах различных опухолей в печень) [10].

Другим онкомаркером, нашедшим широкое применение, является CD44 – интегральный клеточный гликопротеин, рецептор гиалуроновой кислоты, играющий важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Показано, что CD44 непосредственно связан с мобилизацией кальция и способствует процессу метастазирования меланомы, а также участвует в опухоль-ассоциированном воспалении [11, 12].

В клинической практике оценка уровня белков S100 и CD44 обычно осуществляется стандартно в сыворотке крови онкобольных. Представляет значительный интерес определение уровня этих онкомаркеров в самой опухоли, точнее в гомогенатах тканей меланомы и невусов, полученных при их хирургическом иссечении. Это позволяет повысить прогностическую значимость данных критериев в оценке пролиферативного потенциала самой опухоли в соотношении с особенностями ее биохимической среды. Определение уровня CD44 в ткани опухоли и ее микроокружении оказалось интересным при раке и полипах толстой кишки [13, 14].

Цель исследования. Сравнительная оценка содержания онкоспецифических маркеров CD44 и S100В и некоторых биохимических показателей белкового и липидного обмена в гомогенатах тканей меланомы, невусов, перифокальной зоны и линии резекции как информативных факторов для уточнения патогенеза меланоцитарных образований кожи и дифференциальной диагностики заболевания.

Материалы и методы. Было изучено 63 образца ткани меланомы кожи, перифокальной зоны опухоли и линии резекции, полученных при оперативном иссечении опухоли 23 больных с меланомой кожи рТ1-4N0-1M0, и 37 образцов ткани невуса, его перифокальной зоны и линии резекции от 14 пациентов. Тканью перифокальной зоны считали образцы кожи на расстоянии 1 см от видимого края опухоли, а тканью по линии резекции – образцы кожи на расстоянии 2–3 см от видимого края меланомы или невуса. Для сравнения использовали образцы здоровой кожи, полученные при реконструктивно-пластических операциях пациентов без онкопатологии. Во всех случаях получено письменное добровольное информированное согласие больных.

Исследовали содержание специфических маркеров меланомы CD44 и S100 и некоторые биохимические показатели белкового и липидного обмена в надосадочной жидкости, полученной при центрифугировании гомогенатов изучаемых тканей. Использовали 10 % цитозоли, приготовленные на калийфосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. Уровень опухолевых маркеров определяли методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) на ИФА-анализа-торе Tecan (Австрия) с использованием стандартных тест-систем: Fujirebio (Швеция) и Bender MedSystems (США). Содержание общего белка, холестерина и триглицеридов определяли на биохимическом анализаторе Chem Well (США) унифицированными методиками с использованием наборов реактивов «Ольвекс Диагностикум» (г. Санкт-Петербург). Белковые фракции определяли в надосадочной жидкости турбидиметрическим методом на биохимическом анализаторе Chem Well (США).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0. Для оценки уровня значимости различий использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05, на уровне статистической тенденции к значимости – при 0,05

Результаты. Статистически значимое увеличение уровня S100В наблюдали во всех исследованных тканях больных меланомой. Наибольшее увеличение (в 28 раз (р<0,001)) относительно здоровой кожи было характерно для опухолевой ткани меланомы. В перифокальной зоне меланомы уровень данного белка относительно здоровой кожи был повышен в 5,9 раза (р<0,001), а на линии резекции – в 3,4 раза (р<0,01). При этом содержание онкомаркера в ткани меланомы превос- ходило его значение в перифокальной зоне в 4,7 раза и на линии резекции в 8,2 раза. Уровень статистической значимости в обоих случаях был максимальным (р=0,000000). Содержание S100В в перифокальной зоне было на 72,6 % выше, чем в образцах ткани на линии резекции (р<0,02) (табл. 1).

При невусах увеличение уровня S100В было значительно менее выраженным. Статистически значимое превышение уровня белка в здоровой коже выявлено только в ткани самого невуса – в 4,1 раза (р<0,05). В перифокальной зоне невуса содержание S100В было на 84,3 % ниже, чем в самом невусе (р<0,00001). Образцы ткани, полученные на линии резекции при иссечении невуса, оказались неоднородными: в 6 из 13 образцов уровень S100В был в 5,8 раза (р<0,0001) выше, чем в здоровой ткани, и значимо не отличался от среднего уровня в невусах; в остальных 7 образцах увеличения уровня онкомаркера не отмечено (табл. 1).

В отличие от S100В, концентрация онкомаркера CD44 была сопоставима в тканях опухоли при меланоме и в невусах. В ткани меланомы увеличение CD44 составило 106,2 % (р<0,00001), а в невусах – 48,4 % (р=0,05) относительно здоровой кожи. При этом в опухолевой ткани меланомы уровень данного маркера был на 38,8 % выше, чем в невусах (р<0,01). В перифокальной зоне и на линии резекции статистически значимого увеличения CD44 относительно здоровой кожи не наблюдалось ни при меланоме, ни в случае невусов. При меланоме уровень CD44 в ткани опухоли превышал концентрацию данного белка в перифокальной зоне на 70,2 % (р<0,0001) и в ткани линии резекции на 102,9 % (р=0,000000). В отличие от меланомы, при невусах отсутствовали значимые различия между тканями опухоли, перифокальной зоны и линии резекции (табл. 1).

Поскольку оба изученных нами маркера являются белками, интересно было сопоставить выявленные нами особенности их содержания в тканях опухоли и ее окружения при меланоме и невусах с концентрацией общего белка и белковыми фракциями в тех же образцах тканей.

Таблица 1

Содержание белка S100В и гликопротеина CD44 в тканях меланомы и невусов, нг/г ткани

Ткани	S100В	CD44
Здоровая кожа, n=7	1,240±0,304	14,71±1,85
Меланома
Опухоль, n=16	34,732±4,720 р=0,000188	30,33±1,58 р=0,000009
Перифокальная зона, n=19	7,350±0,882 р=0,000883 р 1 =0,000000	17,82±1,85 р 1 =0,000016
Линия резекции, n=14	4,258±0,650 р=0,008794 р 1 =0,000001 р 2 =0,012863	14,95±1,7 р 1 =0,000000
Невусы
Опухоль, n=12	5,115±0,898 р=0,007420 р 3 =0,000010	21,83±2,38 р=0,054278 р 3 =0,004720
Перифокальная зона, n=12	0,803±0,159 р 3 =0,000003	18,38±2,82
Линия резекции, n=13	3,719±0,998 а) 7,132±0,890 (n=6) р=0,000094 б) 0,794±0,216 (n=7) р 4 =0,000013	15,48±2,98

Примечание. Статистическая значимость различий: р – относительно здоровой кожи, р₁ – относительно опухоли, р₂ – относительно перифокальной зоны, р₃ – между тканями меланомы и невусов, р₄ – между подгруппами. Значения р указаны только для статистически значимых различий или имеющих статистическую тенденцию к значимости.

Как видно из табл. 2, при меланоме содержание общего белка как в самой опухоли, так и в окружающих ее тканях значимо не отличалось от уровня в здоровой коже. В то же время его уровень в перифокальной зоне опухоли был выше, чем в образцах ткани, полученных на линии резекции, на 25 % (р=0,01).

В отличие от меланомы, во всех исследованных тканях при невусах содержание белка было статистически значимо ниже, чем в здоровой коже и соответствующих тканях больных меланомой: в ткани невуса – на 40,4 % относительно здоровой кожи и на 40,8 % относительно ткани меланомы (0,005<р<0,01); в перифокальной зоне невуса – на 57,7 % (р<0,005) и 61,6 % (р<0,00001) соответственно; в ткани линии резекции невуса – на 32,1 % (р<0,01) ниже, чем в здоровой коже, и на

23,1 % (р<0,05) ниже, чем в ткани линии резекции при удалении меланомы.

При анализе белковых фракций оказалось, что максимальные различия касались альбуминов и γ-глобулинов. Статистически значимое изменение процентного содержания фракции альбуминов было характерно только для опухолевой ткани меланомы, в которой уровень альбуминов снижался на 60,4 % относительно здоровой кожи и оказался ниже, чем в перифокальной зоне и на линии резекции меланомы, а также во всех тканях невусов, на 57,9–59,6 % с максимальным уровнем значимости (р=0,000000). При этом в опухолевой ткани меланомы происходило резкое увеличение фракции γ-глобулинов – в 2,5 раза по сравнению здоровой кожей и в 1,9–2,5 раза по сравнению с остальными тканями меланомы и невусов (р<0,05).

Таблица 2

Ткани	Общий белок, мг/г ткани	Белковые фракции, %
		альбумин	а-глобулин	в-глобулин	Y-глобулин	К=альб./у-глоб.
Здоровая кожа, n=7	4,42±0,31	34,52±1,36	23,74±2,04	25,22±2,16	16,52±0,68	2,102±0,114
Меланома
Опухоль, n=17	4,44±0,43	13,67±1,08 р=0,000000	21,36±0,61	23,12±0,61	41,82±1,00 р=0,000000	0,436±0,093 р=0,000000
Перифокальная зона, n=16	4,875±0,240	33,14±1,7 р 1 =0,000000	26,73±0,65 р=0,077837 р 1 =0,000001	22,98±0,57	17,15±1,65 р 1 =0,000000	2,563±0,465 р 1 =0,000064
Линия резекции, n=12	3,900±0,255 р 2 =0,010978	32,600±1,299 р 1 =0,000000	25,03±1,21 р 1 =0,006791	21,67±0,83 р=0,075419	20,70±1,32 р=0,068401 р 1 =0,000000	1,710±0,197 р 1 =0,000001
Невусы
Опухоль, n=12	2,633±0,349 р=0,007894 р 3 =0,004715	32,61±0,65 р 3 =0,000003	22,45±0,57	23,21±0,63	21,71±0,47 р=0,000021 р 3 =0,000000	1,492±0,043 р=0,000017 р 3 =0,000000
Перифокальная зона, n=9	1,871±0,458 р=0,001853 р 3 =0,000003	33,86±0,53	25,51±0,61 р 1 =0,001746	23,87±0,76	16,88±0,53 р 1 =0,000002	2,024±0,080 р 1 =0,000006
Линия резекции, n=9	3,000±0,251 р=0,004697 р 2 =0,037730 р 3 =0,023840	32,49±0,33 р=0,083365	23,81±0,97	23,89±0,39 р 3 =0,041550	19,80±0,85 р=0,022794 р 1 =0,049235	1,673±0,089 р=0,012809 р 1 =0,063916 р 2 =0,009781

Содержание общего белка и распределение белковых фракций в тканях меланомы и невусов

Примечание. Статистическая значимость различий: р – относительно здоровой кожи, р₁ – относительно опухоли, р₂ – относительно перифокальной зоны, р₃ – между тканями меланомы и невусов. Значения р указаны только для статистически значимых различий или имеющих статистическую тенденцию к значимости.

Относительно здоровой кожи наблюдалась тенденция к повышению фракции γ-гло-булинов в ткани линии резекции меланомы на 25,3 % (0,05<р<0,1) и повышение этой фракции в ткани невусов и на линии их резекции на 31,4 % (р<0,0001) и 19,9 % (р<0,05) соответственно.

Просматривалась лишь тенденция к повышению фракции α-глобулинов в перифокальной зоне меланомы на 12,6 % и тенденция к снижению фракции β-глобулинов в ткани линии резекции меланомы на 14,1 %. Для лучшей наглядности изменений фракционного состава белков, происходящих в раз- ных тканях при меланоме и невусах, мы рассчитали коэффициент соотношения альбуминов и γ-глобулинов (Кальб./γ-глоб.). Относительно здоровой кожи этот показатель был снижен в опухолевой ткани меланомы в 4,8 раза (р=0,000000), в ткани невуса и его линии резекции – на 29 % (р<0,0001) и 20,4 % (р<0,02) соответственно. При этом данный коэффициент в опухолевой ткани меланомы был ниже в 3,4 раза (р=0,000000), чем в ткани невусов, в 4,6–5,9 раза (р<0,0001) относительно перифокальных зон обоих новообразований и в 3,8–3,9 раза (р<0,000001) относительно линий их резекции.

При изучении показателей липидного обмена (табл. 3) была выявлена слабо выраженная тенденция (р=0,09) к увеличению содержания холестерина в опухолевой ткани меланомы, где, однако, оно было выше, чем в тканях перифокальной зоны и линии резекции, почти в 3 раза (р<0,01). В тканях невусов значимые изменения содержания холестерина отсутствовали.

Таблица 3

Содержание холестерина и триглицеридов в тканях меланомы и невусов, мг/г ткани

Ткани	Холестерин	Триглицериды
Здоровая кожа, n=7	0,132±0,080	0,197±0,004
Меланома
Опухоль, n=21	0,303±0,047 р=0,092426	0,596±0,086 р=0,001641
Перифокальная зона, n=23	0,100±0,014 р 1 =0,000097	0,330±0,095 р 1 =0,055401
Линия резекции, n=19	0,111±0,034 р 1 =0,002418	0,474±0,130 р=0,054041
Невусы
Опухоль, n=14	0,205±0,040	0,423±0,079 р=0,019797
Перифокальная зона, n=12	0,153±0,038	0,308±0,052 р=0,029208
Линия резекции, n=11	0,192±0,040	0,203±0,045 р 1 =0,029394 р 3 =0,056571

Примечание. Статистическая значимость различий: р – относительно здоровой кожи, р₁ – относительно опухоли, р₃ – между тканями меланомы и невусов. Значения р указаны только для статистически значимых различий или имеющих статистическую тенденцию к значимости.

Содержание триглицеридов в опухолевой ткани меланомы и в ткани на линии резекции было увеличено относительно уровня в здоровой коже в 3 раза (р<0,01) и в 2,4 раза (р=0,05) соответственно, в ткани невуса и в его перифокальной зоне – в 2,1 и 1,6 раза (р<0,05) соответственно. При этом содержание триглицеридов в новообразованиях превышало их уровень в прилегающих тканях, что наблюдалось как при меланоме, так и при невусах (табл. 3).

Обсуждение. Полученные данные свидетельствуют о том, что для опухолевой ткани меланомы характерно резкое увеличение уровня S100В, многократно превышающего его значения в здоровой коже и в других исследованных образцах ткани. Результаты наших исследований согласуются с данными литературы, согласно которым уровень белка S100B в крови хорошо соотносится с клинической стадией меланомы, в связи с чем его определение в сыворотке крови предлагается использовать для прогноза и мониторинга лечения пациентов с диагностированной злокачественной меланомой [12, 15, 16].

Наибольшее различие в концентрации общего белка при меланоме и невусах было выявлено в перифокальной зоне, где разница достигала 2,6 раза, в то время как на линии резекции и в ткани опухоли его уровень различался в гораздо меньшей степени. В этом состояло его принципиальное отличие от других изученных онкомаркеров: содержание CD44 в перифокальной зоне и на линии резекции как меланомы, так и невусов не различалось, так же как не отличалось от его уровня в здоровой коже, а многократное повышение уровня белка S100В было характерно лишь для опухолевой ткани меланомы.

При этом наблюдалось выраженное изменение фракционного состава белков, заключающееся в почти пятикратном снижении коэффициента соотношения альбуминовой и γ-глобулиновой фракций, что позволяет предполагать особую значимость нарушения иммунных процессов в ткани меланомы. В тканях невусов, а также в окружающих меланому тканях изменения всех изученных нами показателей белкового обмена были значительно менее выражены, чем в ткани меланомы, или отсутствовали совсем.

Выявленные различия в содержании триглицеридов в ткани опухоли и прилегающих к ней тканях при меланоме и невусах, а также в содержании холестерина при меланоме указывают на нарушение при неоплазии не только белкового, но и липидного обмена.

Увеличение лишь фракции γ-глобулинов в опухолевой ткани меланомы на фоне снижения альбуминов и отсутствия изменений других глобулинов позволяет высказать предположение о том, что изученные нами в качестве онкомаркеров белки S100В и CD44 относятся к фракции γ-глобулинов. С этим согласуется также умеренное, но статистически значимое увеличение уровня S100В,

CD44 и фракции γ-глобулинов в ткани невусов.

Заключение. Данные, полученные в ходе проведенного исследования, позволяют прийти к заключению о наиболее высокой специфичности белка S100В в качестве онкомаркера меланомы. Установлено, что в опухолевой ткани меланомы происходит многократное повышение уровня S100В и менее значительное и специфичное увеличение CD44. Высокоспецифичное повышение уровня S100В в ткани меланомы может представлять интерес в качестве прогностического критерия развития процесса и определения персонализированной тактики лечения этого чрезвычайно агрессивного заболевания, что, однако, требует дальнейших исследований белков семейства S100 при меланоме на значительно большем клиническом материале с анализом зависимости уровня онкомаркера от стадии и клинической картины течения заболевания.

В отличие от рутинных исследований биомаркеров в крови, комплексная оценка концентрации белков непосредственно в гомогенатах тканей опухоли и прилегающих к ней зон позволяет уточнить сведения о патогенезе меланоцитарных образований кожи, что может способствовать повышению прогностической значимости онкомаркеров меланомы.