Изучение полиморфизма генов липидного обмена и жирномолочности джерсейской породы коров на примере ООО имени Тимирязева

Сегодня молочное скотоводство – это одна из важных отраслей животноводства Российской Федерации, которая в последние годы активно поддерживается государством и демонстрирует стабильные темпы роста производства молока. Молочное животноводство активно участвует в формировании системы национальной продовольственной безопасности страны. Молоко – отличный источник витаминов и минералов, углеводов, особенно белка и кальция. Молочный жир содержит в своем составе незаменимые жирные кислоты. В состав молочного жира входят около 20 жирных кислот. Мечта каждого фермера иметь животных, которые будут приносить прибыль, а уход за ними и их содержание были бы легкими и выгодными. Для этого достаточно приобрести джерсейских коров. Джерсейскую породу коров считают одной из самых древних и жирномолочных. Назвали коров джерсейскими по причине места рождения, появились они на острове Джерси между Францией и Англией. Именно там началось разведение породы, как племенного скота, используя генетический материал нормандского и британского крупного рогатого скота. Для того, чтобы не было скрещиваний, в 1789 году запретили завозить на остров Джерси каких-либо коров. В племенную книгу порода была занесена в 1866 году, где были сведения о ее продуктивности. Джерсейская порода долго сохраняла свою чистокровность в связи с запретом властей на экспорт племенного скота. За пределы своей родины джерсейские животные были впервые вывезены только в начале 19 века. Изначально породу завезли в Англию и США. Затем порода получила широкое распространение по всему миру, в том числе и в России [1, 6].

Племенная работа в Республике Татарстан включает в себя внедрение новейших достижений в области ДНК-технологий, биотехнологии животных, генетики и селекции, ввиду того, что результативность работы селекционера в молочном скотоводстве напрямую связана с изучением генетических и паратипических факторов. Изучение и усовершенствование методов оценки племенных качеств в популяциях молочного скота для увеличения молочной продуктивности с применением ДНК-технологий, является востребованным во все времена, особенно в условиях геополитического положения и импортозамещения [7, 11].

Исследования многих отечественных и зарубежных авторов показывают возможность использования

ДНК-технологий в племенном деле, в частности ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, которая приобретает большое значение для оценки генетического потенциала животных. Определение разнообразия одного и того же гена позволяет изучать наследственность на уровне нуклеиновых кислот с использованием генетических маркеров, что в свою очередь даёт возможность устанавливать наличие ценнейших вариантов генов, связанных с соответствующими хозяйственно-ценными признаками [1, 8].

Потенциальными генами-кандидатами, связанными с жирномолочностью коров, могут рассматриваться аллели генов лептина (LEP) и тиреоглобулина (TG5). Лептин -это гормон, оказывающий влияние на липидный обмен, потребление и баланс энергии, живую массу, показатели воспроизводства, а также на молочную продуктивность. Тиреоглобулин - это гликопротеин, который является предшественником гормонов щитовидной железы, оказывающий влияние на липидный метаболизм, ген тиреоглобулина связан с молочной продуктивностью, жирномолочностью и качественным составом молока [2, 3, 16].

Целью работы являлось, выявление полиморфизма генов липидного обмена LEP и TG5 с помощью ДНК-диагностики у коров джерсейской породы и изучение качественных и количественных показателей молочной продуктивности животных.

Материал и методы исследований. Научно-хозяйственные опыты были проведены в ООО имени Тимирязева Балтасинского района Республики Татарстан (село Норма). Для этого нами были отобраны пробы крови (ДНК) у коров джерсейской породы в количестве 87 голов. Кровь у животных отбирали из хвостовой вены, с помощью вакуумных пробирок с 100мМ ЭДТА. Анализ качества молока, экспресс-оценку процентного содержания жира, сухого обезжиренного молочного остатка

(СОМО) и плотности в одной пробе свежего цельного молока - определение его состава проводили на анализаторе молока Клевер-2. Все исследуемые животные находились в одинаковых условиях технологического содержания, кормления и ветеринарного обслуживания.

Работы с ДНК проводились в отделе молекулярных исследований Татарского филиала ФГБУ «ВНИИЗЖ». Генетический материал (ДНК) выделяли стандартным набором «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (Россия) предназначенным для экстракции нуклеиновых кислот из биологического               материала.

Амплификацию    фрагментов    гена тиреоглобулина (TG5) осуществляли с помощью следующих праймеров:

TG5-F:   5‘-GGG-GAT-GAC-TAC-

GAG-TAT-GAC-TG-3’,

TG5-R:    5‘-GTG-AAA-ATC-TTG-

TGG-AGG-CTG-TA-3’.

и      для      тетрапраймерной амплификации фрагментов гена лептина (LEP):

LEP-F1:   5‘-GAC-GAT-GTG-CCA-

CGT-GTG-GTT-TCT-TCT-GT-3 ‘,

LEP-R1:   5 ‘-CGG-TTC-TAC-CTC-

GTC-TCC-CAG-TCC-CTC-C-3',

LEP-F2:   5‘-TGT-CTT-ACG-TGG-

AGG-CTG-TGC-CCA-GCT-3 ‘,

LEP-R2:   5‘-AGG-GTT-TTG-GTG-

TCA-TCC-TGG-ACC-TTT-CG-3 ',

Амплификацию проводили с 2 мкл ДНК-образца, общий объем реакционной смеси в одной пробирке составлял 20 мкл. Для    проведения    рестрикционного гидролиза     гена     тиреоглобулина использовался фермент эндонуклеаза BstX2 I. Пробы расщепляли согласно рекомендации протокола производителя. Смесь помещали в термостат (Binder, Германия) на 2 часа при 37°С.

Затем методом горизонтального электрофореза в 2-2,5 % агарозном геле определяли молекулярный вес продуктов ПЦР-ПДРФ-анализа. Для приготовления геля использовали агарозу, трис-боратный буфер (TBE-буфер), 10 %-ный бромистый этидий 5мкл. Электрофорез проведен при 200мА,  150В, 20Вт (Эльф-8, ДНК-

Технология,     Россия).     Результаты электрофореза детектировали с помощью видеодокументирующей системы GelDoc (BioRad, США).

Результат исследований. В результате амплификации ДНК лейкоцитов крови коров джерсейской породы в тетрапраймерной ПЦР и последующего анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза были получены специфические фрагменты гена LEP длиной 239 пар нуклеотидов, также было выявлено два аллеля лептина – С и Т и три генотипа – LEPТТ, LEPCT и LEPСС. Гомозиготному генотипу ТТ соответствует 239/131 п.н., гетерозиготному генотипу CT – 239/164/131 п.н., гомозиготному генотипу СС – 239/164 п.н. (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Результаты ПЦР-ПДРФ гена LEP крупного рогатого скота с праймерами F1, R1, F2, R2. Обозначения: М – ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp; 1, 4 – генотип CT (239/164/131 п.н.); 2, 3 – генотип СС (239/164 п.н); 5, 6 – генотип ТТ (239/131 п.н.)

Из 87 исследованных животных по гену LEP, 19 коров оказались носителями гомозиготного генотипа ТТ, 36 коров имели гетерозиготный генотип CT, 32 коровы – гомозиготный генотип СС. Частота встречаемости гомозиготного генотипа ТТ составила 21,8%, гетерозиготного генотипа CT – 41,4 %, гомозиготного генотипа СС – 36,8 %. Частота встречаемости аллеля Т – 0,45, аллеля С – 0,55. Проведенное исследование воздействия полиморфизма гена лептина на молочную продуктивность 87 коров, принадлежащих ООО имени Тимирязева Балтасинского района Республики Татарстан, показало, что коровы с гомозиготным генотипом LEPTT имеют самый высокий удой - в среднем 6976,3 кг молока. Коровы с гетерозиготным генотипом LEPCТ имеют более низкий удой в среднем 6745 кг, а у коров с гомозиготным генотипом LEPСC наблюдается наименьший удой - 6462,8 кг.

Наибольшее содержание жира наблюдается у коров с генотипом LEPTT – 7,28 %; на втором месте группа коров с генотипом LEPСТ – 6,08%; наименьшее содержание жира в молоке у коров с гомозиготным генотипом LEPCC – 5,46%.

Распределение белка в молоке оказалось следующим: коровы с генотипом LEPTT – 3,82%, с генотипом LEPCC – 3,98% и с генотипом LEPCT – 3,95% (Таблица 1).

Таблица 1 – Продуктивность коров с различными генотипами по гену LEP

Генотип LEP	Показатели продуктивности коров
	Удой, кг	Жир, %	Белок, %	Массовая доля жира, кг	Массовая доля белка, кг
TT (n=19)	6976,3 + 1083,04	7,28 + 0,86	3,82 + 0,40	507,87 + 9,31	266,49 + 4,33
CT (n=36)	6745 + 1085,07	6,08 + 0,94	3,98 + 0,49	410,1 + 10,2	268,45 + 5,32
CC (n=32)	6462,8 + 1021,68	5,46 + 0,86	3,95 + 0,39	352,87 + 8,79	255,28 + 3,98

Таким образом, коровы с гомозиготным генотипом лептина LEPTT имеют лучшие количественные показатели молочной продуктивности, чем коровы с генотипом LEPCC. Их средний удой составляет 6976,3 кг, что на 513,5 кг больше, чем у коров с генотипом LEPCC. Коровы с генотипом LEPTT также имеют наибольшую жирномолочность – 7,28 % и при среднем удое в 6976,3 кг выдают 507,87 кг молочного жира и массовая доля жира на 155 кг больше у данной группы коров.

В результате амплификации ДНК лейкоцитов крови коров джерсейской породы с парой праймеров TG5-F: 5′-GGG-

GAT-GAC-TAC-GAG-TAT-GAC-TG-3′ и

TG5-R:    5′-GTG-AAA-ATC-TTG-TGG-

AGG-CTG-TA-3′    были    получены специфические фрагменты гена TG5 длиной 548 пар нуклеотидов. После дальнейшего рестрикционного гидролиза продуктов амплификации с ферментом BstX2I и электрофоретического разделения фрагментов в агарозном геле в гене TG5 исследуемых коров выявлено два аллеля С и Т и три генотипа TG5ТТ, TG5СТ, TG5СС. Гомозиготному      генотипу      ТТ соответствуют фрагменты 473/75  п.н., гетерозиготному генотипу СТ – 473/295/178/75    п.н., гомозиготному генотипу СС – 295/178/75 п.н. (Рисунок 1).

Рисунок 2 – Результаты ПЦР-ПДРФ гена TG5 крупного рогатого скота с праймерами TG5-F, TG5-R и эндонуклеазным расщеплением ферментом BstX2 I. Обозначения: М – ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp; 1 – генотип ТТ (473/75 п.н); 2, 3, 6, 8 – генотип СС (295/178/75 п.н); 4, 5, 7 – генотип СТ (473/295/178/75 п.н.)

Из 87 исследованных животных по гену TG5, 15 коров оказались носителями гомозиготного генотипа ТТ, 46 коров имели гетерозиготный генотип СТ, 26 коров – гомозиготный генотип СС. Частота встречаемости гомозиготного генотипа ТТ составила 17,24 %, гетерозиготного генотипа СТ – 52,87 %, гомозиготного генотипа СС – 29,89 %. Частота встречаемости аллеля Т – 0,46, аллеля С – 0,54.

Результаты исследования влияния полиморфизма гена тиреоглобулина на молочную продуктивность были получены путем анализа 87 коров, принадлежащих

ООО имени Тимирязева Балтасинского района Республики Татарстан. Было выявлено, что наибольший удой был у коров с желательным гомозиготным генотипом TG5TT - в среднем 6944,67 кг молока, у коров с гетерозиготным генотипом TG5СT - 6707,61 кг, а у коров с гомозиготным генотипом TG5CC -наименьший удой – 6517,69 кг.

Наибольшее содержание жира наблюдается у коров с генотипом TG5TT – 6,63 %; на втором месте группа коров с генотипом TG5CT – 6,19 %; наименьшее содержание жира в молоке у коров с генотипом TG5CC – 5,68 % (Таблица 2).

Таблица 2 – Продуктивность коров с различными генотипами по гену TG5

Генотип TG5	Показатели продуктивности коров
	Удой, кг	Жир, %	Белок, %	Массовая доля жира, кг	Массовая доля белка, кг
TT (n=15)	6944,67 + 1068,09	6,63 + 1,04	3,9 + 0,29	460,4 + 11,11	270,84 + 3,10
CT (n=46)	6707,61 + 1105,99	6,19 + 1,18	3,95 + 0,41	415,2 + 13,05	264,95 + 4,53
CC (n=26)	6517,69 + 1028,00	5,68 + 0,90	3,93 + 0,54	370,2 + 9,25	256,15 + 5,55

Анализ трех полиморфных локусов, отвечающих за характеристики молочной продуктивности, показал, что есть связь между качественными и количественными показателями лактации. Изучение влияния полиморфизма гена TG5 на лактацию показало, что у животных с генотипом TG5TT продуктивность за 305 дней лактации была выше, чем у животных с генотипом TG5CC - разница составляла 426,98 кг. Коровы, обладающие генотипом TT, опережали своих собратьев с генотипом CC по содержанию жира в молоке на 0,95% и по массовой доле жира - 90,2 кг.

Исследованиями показано, что удой, содержание жира и белка в молоке определяются комплексным сочетанием генотипов, поэтому были осуществлен глубокий анализ частоты встречаемости сочетаний генотипов генов LEP и TG5 в комплексном варианте. В результате анализа встречаемости комплексных генотипов среди 87 коров было выявлено 9 различных комплексных генотипов.

Таблица 3 – Молочная продуктивность коров в зависимости от комплексных генотипов генов LEP и TG5

Генотип	Количество		Показатели молочной продуктивности
	Голов	%	Удой, кг	Жир, %	Белок, %	Массовая доля жира, кг	Массовая доля белка, кг
LEPCCTG5CC	12	13,8	6624,17 + 944,46	5,17 + 0,80	3,93 + 0,41	342,47 + 7,56	260,33 + 3,87
LEPCCTG5CT	14	16,1	6119,29 + 790,00	5,36 + 0,56	3,98 + 0,37	327,99 + 4,42	243,55 + 2,92
LEPCCTG5TT	6	6,9	6941,67 + 1330,47	6,3 + 1,04	3,92 + 0,36	437,33 + 13,84	272,11 + 4,79
LEPCTTG5CC	10	11,5	6496 + 1080,65	5,92 + 0,73	3,79 + 1,41	384,56 + 7,89	246,2 + 15,24
LEPCTTG5CT	19	21,8	6788,95 + 837,04	6,02 + 0,84	3,95 + 0,29	408,69 + 7,03	268,16 + 2,43
LEPCTTG5TT	7	8	6981,43 + 958,17	6,49 + 0,77	3,89 + 0,20	453,09 + 7,38	271,58 + 1,92
LEPTTTG5CC	4	4,7	6252,5 + 1080,77	6,65 + 0,32	4,28 + 0,13	415,79 + 3,46	267,61 + 1,41
LEPTTTG5CT	13	14,9	7222,31 + 1061,92	7,34 + 0,90	3,68 + 0,37	530,12 + 9,56	265,78 + 3,93
LEPTTTG5TT	2	2,3	6825 + 115,00	8,15 + 0,25	3,75 + 0,25	556,24 + 0,29	255,94 + 0,29

В результате проведенных исследований с применением ДНК технологий было выявлено, что коровы с комплексным генотипом LEPTTTG5CT обладают наивысшим удоем – 7222,31 кг, демонстрируют неплохие результаты по содержанию жира, в частности, процентное содержание жира составляет 7,34 %, а массовая доля жира - в среднем 530,12 кг. Из числа исследованных коров всего 14,9 %, владеют таковым комплексным генотипом. Коровы с генотипом LEPTTTG5TT имеют высокий уровень удоя – 6825 кг., и самый высокий показатель содержания жира – 8,15% и наивысшую массовую долю жира 556,24 кг, однако таких коров 2,3%. Большинство коров обладают генотипом LEPСTTG5СT, который характеризуется средними значениями по всем показателям (Таблица 3).

Заключение. Молочному скотоводству, которому в последние годы активно помогает государство и демонстрирующему стабильные темпы роста производства молока, участвующему в формировании системы национальной продовольственной безопасности страны -рекомендуется приобретать коров джерсейской породы, животных с комплексным генотипом LEPTTTG5TT, обладающих высоким удоем, демонстрирующих наивысшие результаты по содержанию жира и его массовой доли. Животные будут приносить прибыль, бизнес будет рентабельным легким и выгодным. А для получения успеха в селекционной работе, которая по большей части зависит от точности определения племенной ценности животных – обязательно использовать ДНК технологии с целью накопления в стадах животных, имеющих желательные комплексные генотипы.