Изучение продукции оксида азота тромбоцитам больных с метаболическим синдромом

В настоящее время наблюдается высокая распространенность сочетания нарушений углеводного обмена с атеросклерозом, гипертонической болезнью и ожирением, что является основной причиной смертности в индустриально развитых странах. Для такого сочетания был предложен термин «метаболический синдром». В патогенезе данного синдрома важная роль отводится состоянию инсулинорезистентности [1,2,3] . Известно, что при инсулинорезистентности снижается инсулинстимулированная продукция оксида азота эн- вации и формировании микро- и макроангиопатий. По современным представлениям, в стенке сосуда функционирует сложная межклеточная кооперация, включающая эндотелиоциты, гладкомышечные клетки, моноциты, полиморфноядерные лейкоциты и тромбоциты [12,13,14]. Данные об изменении продукции NO моноцитами, нейтрофилами и тромбоцитами – основными участниками межклеточной кооперации, неоднозначны и зачастую носят противоречивый характер. Нарушение продукции оксида азота эндотелиальными и другими видами клеток может быть связано с компонентами метаболического синдрома, но механизмы этого явления остаются малоизученными. Целью данной работы явилось изучение продукции оксида азота тромбоцитами больных с метаболическим синдромом и здоровых доноров.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе выполнения данной работы было обследовано 36 человек. Группу больных, состоящую из 26 больных с сочетанием ИБС, АГ и сахарным диабетом 2-го типа в возрасте от 45-55 лет, обозначили как группу больных с метаболическим синдромом. На основании контрольных параметров компенсации сахарного диабета 2-го типа, предложенных European NIDDM Policy Group, 1993г., больные были разделены на три группы: I группа – больные с компенсированным течением сахарного диабета 2-го типа (n=6); II группа – больные c субкомпенсированным течением (n=10); III группа – больные с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа (n=10). Клиническая характеристика больных представлена в табл. 1. В контрольную группу были включены 10 здоровых добровольцев в возрасте от 35 до 45 лет, не страдающих сахарным диабетом, ожирением, с нормальным артериальным давлением, без сосудистых и эндокринных заболеваний в анамнезе. Для определения продукции дотелиальными и гладкомышечными клетками [6,9,12]. Оксид азота является важным фактором, регулирующим межклеточную адгезию, тонус сосудов и транспорт глюкозы в гладкомышечные клетки [12,14], так же NO регулирует процессы агрегации-дезагрегации тромбоцитов, синтезируясь не только в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, но и в самих тромбоцитах, сдерживая проагрегационное действие тромбоксана А2, осуществляя тем самым саморегуляцию тромбоцитами собственной активности [8]. Модификация NO-синтазной активности тромбоцитов больных с метаболическим синдромом может играть центральную роль в возникновении их гиперакти-

Таблица 1

Клиническая характеристика больных с метаболическим синдромом и здоровых доноров

Показатель	I группа (n=6)	II группа (n=10)	III группа (n=10)	Здоровые доноры (n=10)
Длительность диабета, года	3,0±0,7	4,3 ± 1,0	5,3 ± 0,8	Не выявлено
Длительность артериальной гипертензии, года	7,7 ± 0,5	6,8 ± 1,2	8,8 ± 1,4	Не выявлено
Систолическое АД, мм рт.ст.	157,1 ± 9,0.	158,8 ± 9,5	152,3 ± 5,2 .	123,7 ± 1,2
Диастолическое АД, мм рт.ст.	92,4 ± 4,1.	89,5 ± 3,9.	87,8 ± 2,8.	66,5 ± 0,8
Индекс массы тела, кг/м2	33,3 ± 1,4.	31,4 ± 0,8.	33,0 ± 0,8.	22,9 ± 0,2

Примечание:* – р ≤ 0,05 различия с контролем.

оксида азота тромбоцитами клетки выделяли из венозной крови с 6%-ным ЭДТА путем центрифугирования 15 минут при 200 g, и затем клетки ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса. Определение продукции NO проводили методом конверсии оксигемоглобина в метгемоглобин оксидом азота и изменении абсорбции при 577 нм. Оксигемоглобин получали следующим методом: гемоглобин человека (“Sigma”, США) смешивали с дитионатом натрия “Sigma” (США) и хроматографировали через колонку 30х1 см с сефадексом G-25 (“Pharmacia”, Швеция). Отбирали ярко красную фракцию оксигемоглобина, разливали в пробирки и хранили при -20⁰С, концентрацию гемоглобина определяли при λ =415 нм, коэффициент экстинции 131000 М^-1см^-1[7].

В кювету в раствор Хенкса вносили тромбоциты в концентрации 10⁸ клеток/мл. В качестве индуктора образования оксида азота добавляли адреналин в концентрации 5 мкг/мл (“Технология-Стандарт”, Россия). Расчет продукции оксида азота проводили, оценивая снижение абсорбции оксигемоглобина при λ =577 нм, коэффициент экстинции 11 200 М^-1см^{- 1} и выражали в пмоль NO/мин/10⁸ клеток. Показатели глюкозы, гликозилированного гемоглобина, мочевой кислоты и липидного спектра определяли с помощью стандартных наборов (“Biocon”, Германия). Полученные результаты анализировали с помощью интегрированной системы статистического анализа STATISTICA 6.0. фирмы StatSoft Inc., USA. Статистическую значимость различий параметров сравниваемых групп оценивали по непараметрическим критериям U-Манна-Уитни и Вилкоксона, данные представлены в виде М±m, различия считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости p<0,05. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции Спирмана.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании биохимических показателей во всех группах больных были обнаружены биохимические маркеры метаболического синдрома: гипергликемия, гиперурикемия и дислипидемия, характеризующаяся увеличением общего холестерола, триацилглицеролов и снижением холестерола в ЛПВП (табл. 2). Гипергликемия и гиперурикемия могут приводить к изменению липидного спектра крови. Действительно, при проведении корреляционного анализа в группе больных с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа выявлена положительная взаимосвязь между уровнем триаци-лглицеролов и содержанием гликозилированного гемоглобина (r=0,58; p<0,05), а также содержанием мочевой кислоты (r=0,65; p<0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об атерогенных изменениях липидного спектра крови, наиболее отчетливо выраженных в группе больных с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа и о взаимосвязи изменений углеводного и пуринового обменов с процессами метаболизма липидов. Дислипидемия, гипергликемия и инсулино-резистентность оказывают существенное влияние на функциональные и метаболические характеристики клеток иммунокомпетентной системы [1,7]. Итогом этих сдвигов может быть изменение функционального состояния сердечно-сосудистой системы, в том числе нарушение эндотелийзависимой релаксации сосудов. Моноциты, тромбоциты и эндотелиальные клетки продуцируют оксид азота, который является частью многокомпонентной системы регуляции сосудистого тонуса и обладает антиатерогенным эффектом [14]. Базальная и гормон-индуцированная продукция

Таблица 2

Биохимические показатели больных с метаболическим синдромом и здоровых доноров

Показатель	I группа (п=6)	II группа (п=10)	III группа (п=10)	Здоровые доноры (п=10)
Глюкоза, ммоль/л	5,31 ± 0,45***	6,61 ± 0,73*	8,60 ± 0,8*	4,53 ± 0,11
Гликозилированный гемоглобин, %	7,42 ± 0,27***	7,83 ± 0,29****	8,71 ± 0,22	Не определяли
Мочевая кислота, мкмоль/л	384,25 ± 13,56*	383,82 ± 19,82*	391,78 ± 15,33*	327,50 ± 15,75
Общий холестерол, ммоль/л	5,30 ± 0,32**,***	5,81 ± 0,21*	6,39 ± 0,24*	4,88 ± 0,15
Триацилглицеролы, ммоль/л	1,95 ± 0,18*	2,35 ± 0,24*	3,11 ± 0,478*	1,29 ± 0,06
Холестерол ЛПВП, ммоль/л	1,11 ± 0,07	1,06 ± 0,07*	1,04 ± 0,06*	1,26 ± 0,04
Холестерол ЛПНП, ммоль/л	3,27 ± 0,25	3,63 ± 0,16*	3,98 ± 0,20*	3,12 ± 0,16
Индекс атерогенности	3,03 ± 0,30***	3,50 ± 0,25*	4,06 ± 0,24*	2,44 ± 0,14

Примечание: * - р<0,05 различия с контролем; ** - р<0,05 различия I группы со II; *** - р<0,05 различия I группы с III;

**** - р<0,05 различия II группы с III.

Таблица 3

Базальная и адреналининдуцированная продукция оксида азота тромбоцитами здоровых доноров и больных метаболическим синдромом

Исследованные показатели	Содержание оксида азота (пмоль NO/ мл /108 клеток)
	I группа (n=6)	II группа (п=10)	III группа (п=10)	Контроль (п=10)
Базальная продукция	112,56 ± 12,50	119,12 ± 15,06 *	85,97 ± 9,38 *	230,57 ± 15,47
Адреналин [5 мкг/мл]	105,01 ± 13,42 * ***	121,06 ± 15,43 *	124,03 ± 13,02 * **	180,01 ± 19,72

Примечание: * - р<0,05 различия с контролем; ** - р<0,05 различия между базальной и адреналининдуцированной продукцией оксида азота ; *** - р<0,05 различия I группы с III.

оксида азота отражает степень функциональной активности клеток. При изучении продукции оксида азота тромбоцитами выявлено, что базальная продукция NO во всех группах больных с метаболическим синдромом снижена по сравнению с группой здоровых доноров, причем наиболее низкое образование оксида азота наблюдалось в группе больных с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа (табл. 3). Снижение базального образования оксида азота клетками больных с метаболическим синдромом может быть вызвано различными причинами. В условиях гипергликемии в результате аутоокисления глюкозы образуется супероксидный анион, который взаимодействует с оксидом азота с образованием пероксинитрита, что приводит к снижению содержания NO [5,10]. Известно, что в тромбоцитах функционирует Са2+-кальмоду-линзависимая конститутивная NO-синтаза, поэтому снижение базального образования оксида азота может быть результатом гликозилирования кальмодулина, кроме того, метаболические нарушения могут влиять на экспрессию NO-синтазы в мегакариоцитах и приводить к снижению активности фермента в тромбоцитах [7]. При сахарном диабете наблюдается увеличение адгезивной способности тромбоцитов и отмечается их повышенная спонтанная агрегация [8,11]. На мембране этих клеток присутствуют α2 - и β2 – адренорецепторы, повышение уровня холестерола сопровождается ростом плотности α2-адренорецепторов на мембране тромбоцитов и усилением агрегации клеток в ответ на действие адреналина [4,11]. Механизм адреналининду-цированной агрегации связан с α2 – типом рецепторов, взаимодействие с которыми приводит к ингибированию аденилатциклазы, экспозиции фибриногеновых мест для связывания и образованию тромбоксана А2 [4]. Как известно, оксид азота обладает антиагрегантным действием, в связи с этим одной из задач данной работы явилось изучение влияния адреналина на продукцию оксида азота тромбоцитами. В группе здоровых лиц не было обнаружено статистически значимой разницы между базальной и адреналининдуцированной продукцией NO, но при проведении корреляционного анализа была получена положительная взаимосвязь между уровнем холестерола в сыворотке крови и продукцией NO тромбоцитами в ответ на добавление адреналина (r=0,70; p<0,05). При этом в группе больных с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа, характеризующейся наиболее выраженными нарушениями липидного обмена, добавление адреналина в суспензию клеток увеличивало продукцию оксида азота тромбоцитами (табл. 3). При повышении содержания холестерола, увеличивается агрегация тромбоцитов в ответ на адреналин [4], но одновременно происходит увеличение продукции оксида азота клетками, таким образом, вариации уровня холестерола тесно взаимосвязаны с изменением продукции оксида азота клетками, что позволяет предположить наличие ауторегуляторного механизма, контролирующего гиперагрегацию тромбоцитов.

ВЫВОДЫ

• 1.    Базальная и адреналининдуцированная продукция оксида азота тромбоцитами больных с метаболическим синдромом снижена по сравнению с продукцией оксида азота клетками здоровых доноров.

• 2.    Адреналин в концентрации 5 мкг/мл in vitro приводит к увеличению продукции оксида азота тромбоцитами больных с декомпенсированным течением сахарного диабета 2-го типа.