Изучение профиля антибиотикорезистентности автохтонных микроорганизмов

Одним из направлений использования биотехнологий в земледелии является применение биопрепаратов на основе эффективных почвенных микроорганизмов [9]. Важность бактеризации неоспорима, так как при этом можно полностью отказаться от использования химикатов (азотных, фосфорных и др.). При использовании биопрепаратов повышается не только урожайность, но и качество продукции, усиливается сопротивляемость растений к неблагоприятным факторам (вредителям). Выявлен положительный эффект инокуляции на рост различных растений [3, 9]. Позитивным является и сопутствующий эффект антагонизма бактерий, составляющих основу биопрепарата, к фитопатогенам. При этом механизмы их антагонистической активности разные: синтез антибиотиков, фитогормонов, сидерофоров, предотвращение действия патогенов [7, 11].

Широкое использование антибактериальных препаратов (антибиотиков) привело к увеличению частоты устойчивости к противомикробным препаратам не только среди патогенных микроорганизмов, но даже среди бактерий, на которые антибиотики не действуют напрямую [8]. Множественная устойчивость почвенных бактерий к антибиотикам может быть связана с изменениями в их геноме, что в свою очередь может отражаться на физиологических и биохимических свойствах устойчивых штаммов. Гены, ответственные за устойчивость бактерий к антибиотикам, могут быстро передаваться от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам в процессе горизонтального переноса, что в итоге приведёт к росту устойчивых к антибиотикам микробных сообществ опасных для человека [6].

Из различных почв Республики Татарстан (РТ) нами выделены, изучены и отобраны для создания биопрепаратов диазотрофные, фосфатмобилизующие и углеводородокисляющие автохтонные бактерии. Основные критерии при отборе эффективных микроорганизмов следующие: значительная скорость накопления биомассы индивидуальных штаммов, высокая нитрогеназная, фосфатмобилизующая и углеводородокисляющая активности, способность подавлять развитие фитопатогенных микромицетов, сохранение жизнеспособности и уровня активности при различных температурных режимах и пестицидном стрессе, сроках хранения и т.д. [1, 2].

Цель исследования – определение профиля антибиотико-резистентности автохтонных почвенных бактерий.

Материал и методы исследований. Автохтонные штаммы – Staphylococcus warneri , Pseudomonas stutzeri , Achromobacter xylosoxidans , Bacillus thuringiensis, Brevibacillus laterosporus,

Shinella zoogloeoides – были выделены из различных почв РТ. В дальнейшем их идентифицировали путем секвенирования нуклеотидной последовательности 16S рРНК , а затем депонировали в Ведомственных коллекциях Российской Федерации (ВКПМ, RCAM). Для выращивания бактерий использовали готовую сухую питательную среду – агар Мюллера-Хинтона. Изучали двенадцать антибиотиков: азитромицин (аз), ампициллин (амп), канамицин (кан), левомицитин (лев), налидиксовую кислоту (нал), новобиоцин (нб), офлоксацин (оф), рифампицин (риф), стрептомицин (стр), тетрациклин (тет), ципрофлоксацин (цип), эритромицин (эри).

Определение профиля антибиотикорезистентности проводили диско-диффузиозным методом [5]. Для приготовления инокулята использовали метод прямого суспендирования в стерильном изотоническом растворе колоний чистой 18-24-часовой культуры бактерий, выросшей на плотной неселективной питательной среде. Доводили бактериальную суспензию до оптической плотности 0,5 путем добавления в нее микробной массы или разбавления стерильным изотоническим раствором. Суспензию наносили на поверхность питательного агара, а после подсушивания чашек Петри с инокулированной бактериальной суспензией на поверхность агара – диски с антибиотиками. Количество дисков на одной чашке Петри не превышало четырех, для предотвращения перекрывания зон подавления роста, а также взаимодействия между антибиотиками. После инокуляции и нанесения дисков чашки Петри помещали в термостат вверх дном. Учет результатов проводили на следующие сутки: измеряли диаметр зон задержки роста при помощи линейки. Если диаметр был больше 1 см, то штамм микроорганизмов относили к чувствительному, если меньше – к нечувствительному.

Результат исследований. Устойчивость бактерий к антибиотикам может быть врожденной и приобретенной [3]. Врожденная (природная) устойчивость характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика или недоступностью мишени вследствие исходно низкой проницаемости или ферментативной инактивации. Приобретенная (вторичная) устойчивость возникает в бактериальных популяциях, которые изначально были чувствительны к антибиотикам, после контакта с антимикробным средством и последующего отбора мутаций, придающих этим линиям устойчивость к антибиотику, с которым они контактировали. Однако приобретенная резистентность может возникать путем приобретения внешних генетических детерминант резистентности, которые бывают получены от врожденно устойчивых организмов, присутствующих в окружающей среде.

Почвенные микробы становятся очень популярными и полезными в качестве добавки к химическим удобрениям для повышения качества и урожайности сельскохозяйственных культур и в настоящее время применяются в самых разных сельскохозяйственных системах для повышения производительности и комплексной борьбы с вредителями. В связи с этим микроорганизмы, стимулирующие рост растений, считаются потенциальными участниками устойчивого растениеводства. Однако, прежде чем использовать какой-либо микроорганизм в агробиотехнологии, требуется оценить потенциальный риск непатогенных почвенных бактерий обмениваться генами устойчивости к антибиотикам с человеческими патогенами.

В данном исследовании получены данные об антибиотикорезистентности для шести видов почвенных микроорганизмов. С помощью диско-диффузного метода проанализированы автохтонные штаммы на устойчивость к двенадцати антибиотикам (Таблица 1). Выбранные нами антибиотики действуют на разные точки метаболизма бактериальной клетки: синтез белка (левомицетин, азитромицин, эритромицин, канамицин, стрептомицин, тетрациклин), синтез РНК (рифампицин), синтез ДНК (новобиоцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, налидиксовая кислота) и синтез клеточной стенки (ампициллин).

Таблица 1 – Профили антибиотикорезистентности у исследуемых штаммов бактерий (R – резистентность, S – чувствительность)

Примечание: амп – ампициллин, риф – рифампицин, лев – левомицетин, аз – азитромицин, эри – эритромицин, оф – офлоксацин, цип – ципрофлоксацин, нал – налидиксовая кислота, нб – новобиоцин, канн – канамицин, стр – стрептомицин, тет – тетрациклин

Установлено, что у каждого из шести штаммов присутствует устойчивость хотя бы к одному антибиотику. Устойчивостью к наибольшему числу антибиотиков обладает Achromobacter xylosoxidans (4 из 12). Среди исследуемых штаммов не обнаружено устойчивости к азитромицину и фторхинолонам (офлоксацин и ципрофлоксацин), что делает эти антибиотики наиболее перспективными в клинической практике. Напротив, к эритромицину чувствительны только два штамма – Bacillus thuringiensis и Brevibacillus laterosporus.

Заключение. Представленное исследование открывает двери для лучшего понимания глобального распределения переносимых почвой генов устойчивости к антибиотикам в наземных экосистемах. Мы сообщаем о широком распространении среди автохтонных микроорганизмов устойчивости к эритромицину и об отсутствии среди исследуемых штаммов устойчивости к азитромицину и фторхинолонам (офлоксацин и ципрофлоксацин).

Дальнейшая работа по улучшению фенотипического прогнозирования устойчивости занимает центральное место в планируемом переходе к анализу данных полногеномного секвенирования в качестве основного подхода к характеристике изолятов почвенного происхождения.

Работа выполнена в рамках Государственного задания № FMEG-2021-0003, регистрационный номер 121021600147-1.

Резюме

Из различных почв Республики Татарстан выделены, изучены и отобраны для создания биопрепаратов диазотрофные, фосфатмобилизующие и углеводородокисляющие автохтонные бактерии – Staphylococcus warneri , Pseudomonas stutzeri , Achromobacter xylosoxidans , Bacillus thuringiensis, Brevibacillus laterosporus, Shinella zoogloeoides . Диско-диффузиозным методом у них проведено определение профиля антибиотикорезистентности. Изучены двенадцать антибиотиков: азитромицин, ампициллин, канамицин, левомицитин, налидиксовую кислоту, новобиоцин, офлоксацин, рифампицин, стрептомицин, тетрациклин, ципрофлоксацин и эритромицин. Установлено, что у каждого из шести штаммов присутствует устойчивость хотя бы к одному антибиотику. Устойчивостью к наибольшему числу антибиотков обладает Achromobacter xylosoxidans (4 из 12). К эритромицину чувствительны только два штамма – Bacillus thuringiensis и Brevibacillus laterosporus. Среди исследуемых штаммов не обнаружено устойчивости к азитромицину и фторхинолонам (офлоксацин и ципрофлоксацин), что делает эти антибиотики наиболее перспективными в клинической практике.