Изучение ультраструктуры клетки при разных видах хранения референтных штаммов Cl. botulinum

Сохранение биологических свойств патогенных микроорганизмов осуществляется в ведомственных и государственных коллекциях. Изучение их первоначальных свойств при хранении в музеях необходимо для разработки средств профилактики и диагностики опасных возбудителей болезни. Кроме того, они необходимы для создания различных целевых продуктов в биотехнологической промышленности. Следствие этого в таких коллекциях ведется кропотливая и длительная работа по обеспечению сохранности патогенных свойств микроорганизмов. Одним из таких возбудителей, относящих к особо опасным болезням человека и животных, относится ботулизм.

Ботулизм – острое токсикоинфекционное заболевание, связанное с употреблением в пищу продуктов, содержащих токсин Cl. botulinum, характеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы. Возбудитель подвижная, грамположительная, строго анаэробная, спорообразующая бактерия. В мазках имеет вид палочек с закругленными концами, располагающихся небольшими цепочками. Ботулотоксин является одним из самых сильных биологических ядов [2].

В большинстве коллекций микроорганизмов используют метод лиофилизации, низкотемпературного замораживания и хранения в нативном виде для обеспечения долгосрочного хранения с сохранением исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителей. И в этой связи изучение жизнеспособности культур микроорганизмов необходимо.

Целю данной статьи является обеспечение долгосрочного хранения исходных биологических свойств уникальных коллекционных образцов возбудителя Cl. botulinum .

Материал и методы исследований . В работе были использованы штаммы возбудителя ботулизма: шт. 35 «Nevel» тип А, выделенный из трупа человека; шт. 16-Я тип В, выделенный из фуражного ячменя. Для поддержания референтных штаммов возбудителя ботулизма использовали среду Китта-Тароцци. Оптимальная температура для роста и токсинообразования различных типов возбудителя составила 30-35 ⁰С (Rasetti- Escargueil еt.al., 2019).

Электронная микроскопия – это совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей с помощью электронных микроскопов – приборов, использующих электронный пучок для получения увеличенного изображения.

Важным этапом в комплексе исследований штаммов возбудителя ботулизма, является привлечение возможностей трансмиссионной электронной микроскопии, позволяющей совместно с методами морфометрической обработки данных дать объективную оценку визуализации изучаемых объектов на ультраструктурном уровне.

Целью фиксации биологического материала для гистохимического анализа является перевод живого вещества из лабильного состояния в стабильное, т.е. прекращение процессов аутолиза и стабилизация веществ и структур клетки в такой мере, при которой их локализация, целостность и взаимное расположение практически не изменяются при последующем обезвоживании, заливке в парафин или в смолу, приготовление срезов и воздействие пучка электронов. Наиболее часто используют метод химической фиксации [3, 4].

Результат исследований. Особый интерес в данном направлении представляют выявления и демонстрация «морфологического ответа» Cl. botulinum на ультраструктурном уровне при воздействии различных режимов температуры, что возможно осуществить благодаря методу просвечивающей электронной микроскопии.

Поэтому на первом этапе определяли жизнеспособность штаммов Cl. botulinum шт. 35 «Nevel» тип А и Cl. botulinum шт. 16-Я тип В, для определения жизнеспособности лиофилизированных культур, содержимое ампул ресуспендировали в 1 см3 0,85 % раствора натрия хлорида, штаммы возбудителя ботулизма высевали на среду Китта-Тароцци 1 % глюкозой под слоем вазелинового масла рН 7,4, затем инкубировали при температуре плюс 35 ºС. Культура хранящаяся в нативном виде была также высеяна на среду Китта-Тароцци 1 % глюкозой под слоем вазелинового масла рН 7,4, затем инкубировали при температуре плюс 35º С. Культуры хранящиеся при низкотемпературной консервации (-40 °С; -70°С), через 12 месяцев после закладки культур на низкотемпературное хранение (срок наблюдения) провели учет жизнеспособности выросших колоний исследуемых штаммов путем посева их на среды. Взвесь размораживалась при комнатной температуре в течение 15-20

минут до полного оттаивания содержимого пробирок. Культура также высеяна на среду Китта-Тароцци 1 % глюкозой под слоем вазелинового масла рН 7,4, затем инкубировали при температуре плюс 35

℃.

Выросшие культуры проверяли по биологическим свойствам: готовили мазки и окрашивали по Граму, проверяли чистоту выросших культур, подвижность и их биохимические свойства. Культурально-биохимические свойства проверяли путем посева на среду Гисса с добавлением сахаров, а также по образованию сероводорода. Протеолитическая активность Cl. botulinum определяли путем культивирования в питательных средах, содержащих белки. Культуры со среды Китта-Тароцци c 1 % глюкозой высевали уколом в 12 % желатин и обезжиренное молоко под вазелиновым маслом. Посевы инкубировали при температуре плюс 35 ℃, в течение первых трех суток. Результаты исследований представлены в таблице 1.

При анализе полученных результатов установлено, что штаммы Cl. botulinum, хранившиеся в разных видах – жизнеспособны, биологические свойства соответствуют паспортным данным.

Дальнейшая работа заключалась в приготовлении бактериальной суспензии культур с концентрацией 30 млрд. м.к./мл на физиологическом растворе с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 5 тыс. об/мин., затем осадок отмывали трижды стерильной дистиллированной водой. В очищенную культуру добавляли 1 % глутаровый альдегид (ГА 1 % на 0,1 МФБ), все хорошо смешали и поставили в холодильник 4,0±1,0 °C на 12 часов, по истечении времени, проверяли культуру на стерильность, посевом на среду Китта-Тароцци с 1 % глюкозой под слоем вазелинового масла, инкубировали в термостате при температуре плюс 35 °С в течение 1-3 суток и параллельно, на мясо-      проверки показали, что культура дает рост пептонный агар (МПА) с 2 % глюкозой,      с 1 % глутаровым альдегидом.

инкубировали в анаэростате. Результаты

Таблица 1 – Биологические свойства штаммов Cl. botulinum