Изучение взаимосвязи фермента полифенолоксидазы и синтеза радиотоксинов в облученном организме

Известно несколько путей образования радиотоксинов при облучении биологических объектов. Они могут образовываться за счёт радиолиза определённых веществ (предшественников радиотоксинов) и вторичных радиационнохимических реакций продуктов радиолиза. Ведущая роль при этом принадлежит радиационно-химическим реакциям окисления, особенно активно протекающим в присутствии кислорода. Большое значение в образовании радиотоксинов имеют ферментативные реакции, характер и течение которых изменены радиационным нарушением структурно-метаболических отношений в клетке, тканях и организме в целом [4].

Относительное увеличение концентрации различных фенолов в пострадиационный период, сопровождающееся одновременной активацией полифенолоксидазы способствует накоплению в облученных растениях хиноноподобных радиотоксинов, усугубляющих картину лучевого поражения. Установлено, что малые дозы (0,5-1 кр) значительно активировали эти ферменты в радиочувствительных органах конских бобов [8].

Полифенолоксидаза является металлоферментом, который катализирует окисление монофенолов и о-дифенолов до хинонов, являющихся промежуточными соединениями с очень высокой реакционной способностью. Они легко полимеризуются и вступают в реакцию с нуклеофильными боковыми цепями аминокислот, сшивая белки поперечными связями, за счет чего снижается доступность и питательные свойства белков [2].

Под влиянием пролонгированного действия облучения низкой интенсивности на территориях, подвергшихся радиационному заражению в пределах малых экспозиционных доз, у штаммов почвенных микромицетов Hormoconis resinae 61 и 801 могут вырабатываться радиоадаптивные свойства, связанные с активацией синтеза меланина благодаря повышению активности ферментов полифенолоксидазы и тирозиназы [7]. Установлено, что в стрессовых условиях (при облучении, механическом повреждении, изменении химического состава окружающей среды) в клетке активность ферментов фенолоксидаз возрастает, препятствуя распространению активных форм кислорода [6; 9].

В исследованиях А.В. Корнейко и В И. Гидранович [3] было обнаружено нарастание полифенолоксидазы в тканях плодов телят в пренатальный период развития, что свидетельствует о широком разнообразии метаболитов, включающихся в обмен уже на ранних стадиях онтогенеза животных. Полифенолоксидаза по А.Н. Баху и В.А. Энгельгардту в животном организме содержится в покровных его тканях. Вилланд и Фраге обнаружили ее в сердечной мышце [5]. Таким образом, фенолоксидаза, или полифенолоксидаза – фермент, широко распространенный в составе растительных клеток, но находящийся также в отдельных тканях и органах животных.

Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы было показать в сравнительном аспекте характер метаболических изменений активности фермента полифенолоксидазы в разные сроки после внешнего γ-облучения разными мощностями доз по отношению к необлученным животным образцам, а также установление взаимосвязи изменения активности полифенолоксидазы и накопления радиотоксинов после облучения.

Поскольку полифенолоксидаза участвует в процессе окисления и восстановления фенолов, хинонов в организме, а в стрессовых ситуациях включают процессы инактивации активных форм кислорода (радиотоксинов), представляет интерес изучения динамики образования и инактивации радиотоксинов в облученном организме с участием полифенолоксидазы.

Для изучения данного вопроса в пробах печени облученных белых крыс в вышеуказанных дозах, параллельно определяли концентрацию хиноидных радиотоксинов в РБФ с использованием нановарианта антительного бентонитового диагностикума (нАТБД).

Материал и методы исследований. Объектом исследований являлось сырье животного происхождения: печень необлученных и облученных белых крыс на установке «Пума» при мощности 4,9 Р/мин дозами 350 Р, 700 Р и 950 Р.

Активность фермента исследовали с использованием колориметрического метода. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое окисляет аскорбиновую кислоту за 1 минуту на 1 г исследуемого вещества. Отбор образцов для исследований осуществлялся через 4, 24 ч и 3, 5, 7, 10 суток.

Для определения активности полифенолоксидазы применяли методику, основанную на скорости ферментативного процесса на стадии окисления пирокатехина по количеству, пошедшей аскорбиновой кислоты на восстановление хинона [1]: остаток аскорбиновой кислоты определяли титрованием 0,01 н. раствором йодата калия в присутствии 1 мл 0,5 %-го раствора крахмала до появления неисчезающей желто-лимонной окраски. По количеству йодата калия, пошедшего на окисление аскорбиновой кислоты, вычисляли активность полифенолоксидазы (мкмоль окисленной за 1 мин аскорбиновой кислоты на 1 г исследуемого вещества).

Экспериментальные данные обработаны методом вариационной статистики (M±m). Различия по отношению к контролю считали достоверными при р≤0,05 (по Стъюденту).

Для моделирования острой лучевой болезни и изучения метаболизма радиотоксических веществ в организме сублетально, полулетально и летально облученных животных, опыты проводили на белых крысах обоего пола живой массой 180-200 г, разделенных на 4 группы по 18 животных в каждой. Животных 1-й группы подвергали облучению γ-лучами на установке «Пума» в дозе 3,5 Гр (сублетальная доза – ЛД 0 ); животных 2-й группы – в дозе 7,0 Гр (полулетальная доза – ЛД 50 ); животных 3-й группы – в дозе 9,5 Гр (летальная доза – ЛД 100/30 ), а животные 4-й группы являлись контролем облучения.

Через 4, 24 ч, 3, 5, 7 и 10 суток после облучения из каждой группы в указанные сроки убивали по 3 животных, извлекали печень, готовили из них гомогенаты путем обработки на гомогенизаторе, в течение 60 мин. проводили экстракцию с водой при соотношении 1:3, а затем надосадочную жидкость подвергали иммунохимическому РБФ-анализу на наличие радиоантигена (радиотоксина). Пробы из печени в РБФ-тесте использовали в качестве антиген (радиотоксин) содержащего материала. В качестве детекторной системы в РБФ-тесте использовали нановариант бентонитового диагностикума (нАТБД) на основе наночастиц бентонита Хакасского происхождения.

Результат исследований.

Результаты индикации радиоантигена (радиотоксина) в органах и тканях, облученных в сублетальных (3,5 Гр), полулетальных (7,0 Гр) и летальных (9,5 Гр) дозах животных представлены в таблице1.

Таблица 1– Активность полифенолоксидазы в печени необлученных и облученных белых крыс в динамике (n=3)

Наименование исследуемого сырья	Доза облучения, Гр	Активность полифенолоксидазы (мкмоль окисленной за 1 мин аскорбиновой кислоты на 1 г исследуемого вещества) через
		4 ч	24 ч	3 сут	5 сут	7 сут	10 сут
Печень облученная	3,5	65± 0,58***	82,5± 0,29***	18,75± 0,14***	16,25± 0,14*	8,5± 0,14**	-
	7,0	27,5± 0,29***	35± 0,58***	12,5± 0,14***	6,25± 0,14***	3,25± 0,14*	-
	9,5	18,75± 0,29***	27,5± 0,29***	6,25± 0,14**	3,75± 0,14***	1,5± 0,14*	-
Печень необлученная		12,5±0,06

–Р ≤ 0,05; **– Р ≤ 0,01; *** - Р ≤ 0,001; - - не определяется

Как видно из таблицы 1, активность полифенолоксидазы при всех дозах облучения сначала быстро нарастает (до 24 ч), а затем, начиная с 3 сут, также резко падает, достигая минимальных значений к 7 сут.

Результаты иммунохимического анализа проб печени γ-обученных в разных дозах белых крыс представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Динамика изменения содержания радиотоксинов в печени облученных крыс (log 2 ) (М±m) (n=3)

Наименование исследуемого сырья	Доза облучен ия, Гр	Сроки исследования
		4ч	24 ч	3 сут	5 сут	7 сут	10 сут
Печень облуч.	3,5	0,33± 0,17	2,33± 0,33	2,67± 0,33	3,00± 0,01	3,33± 0,33*	4,00± 1,3*
	7,0	0,67± 0,17	3,33± 0,33*	4,33± 0,33*	4,67± 0,33*	6,00± 0,01**	7,67± 0,33**
	9,5	1,33± 0,33	7,33± 0,33**	7,67± 0,33**	8,00± 0**	8,67± 0,33**	11,33± 0,33**
Печень необлуч.		0,17±0,17

–Р ≤ 0,05; **– Р ≤ 0,01

Из данных таблицы 2 видно, что облучение животных в сублетальной (3,5 Гр), полулетальной (7,0 Гр) и летальной (9,5 Гр) дозах сопровождалось антигенемией (радиотоксинемией) организма, т.е. токсические продукты радиолиза, индуцированные облучением, появлялись в печени, интенсивность накопления которых зависит от дозы радиационного воздействия: чем выше доза, тем больше коэффициент накопления токсического агента в органах и тканях облученных животных.

Дозозависимая взаимосвязь фермента полифенолоксидазы и синтеза радотоксинов в организме облученных белых крыс тремя различными дозами γ-лучей иллюстрируется данными рисунка 1.

Рисунок 1 – Динамика образования радиотоксинов (шкала справа) и активности полифенолоксидазы (шкала слева) после облучения белых крыс в сублетальной, полулетальной и летальной дозах

Из рисунка видно, что между изучаемыми биохимическими показателями (активность полифенолоксидазы и концентрация радиотоксинов) существует обратная корреляционная зависимость: чем больше активность полифенолоксидазы, тем меньше концентрация радиотоксинов и наоборот. Повышение активности полифенолоксидазы в течение 4 и 24 ч и нарастание хинонов в течение 4, 24 ч, 310 сут после облучения было показано в наших экспериментах у γ-облученных животных.

Заключение. Нами была детально изучена активность полифенолоксидазы в печени белых крыс, облученных разными дозами. Полученные в экспериментах данные свидетельствуют о том, что хиноидные радиотоксины в основном образуются в пострадиационный период и их количество во времени после облучения растёт по экспоненте. Это позволяет предположить, что радиационнохимическое образование хинонов (а может быть, и других первично возникающих продуктов подобных реакций) выполняет лишь роль сигналов, триггеров, запускающих ферментативные реакции окисления, ответственные за образование основных количеств хиноидных радиотоксинов. В облученной ткани имеет место значительная активация окислительных ферментов (полифенолоксидазы).

Изменение активности ферментов, как правило, является вторичной реакцией, быстро наступающей в клетке вследствие нарушения её структурной организованности, изменения свойств её внутренних поверхностей, мембран и субмикроскопических структур. Соотношение процессов, возникающих в облучённом организме, определяет степень поражения объекта и с помощью ряда факторов, воздействующих на метаболизм в пострадиационный период, может быть сдвинуто в ту или иную сторону. Несмотря на вторичный характер, эти изменения активности ферментов могут играть существенную, а иногда даже решающую роль в определении дальнейшего течения радиационного поражения и его окончательных результатов для расчета коэффициента степени поражения и защиты.

Целью исследования являлось изучение взаимосвязи активности фермента полифенолоксидазы и синтеза радиотоксинов в облученном организме животных. Эксперименты проводили на лабораторных животных – белых крысах, сформированных в группы в зависимости от дозы облучения. Объектом исследований являлась печень тотально облученных животных, которую исследовали на активность полифенолоксидазы колориметрическим методом и образования радиотоксинов в реакции бентонитовой флокуляции. Установлено, что активность полифенолоксидазы после облучения в течение суток сначала резко возрастает, а начиная с 3 суток, резко падает, тогда как концентрация радиотоксинов, наоборот, увеличивается постепенно и достигает своего максимума к 710 сут, когда фермент полифенолоксидаза инактивирован. Показано, что между изучаемыми биохимическими показателями (активность полифенолоксидазы и концентрация радиотоксинов) существует обратная корреляционная зависимость: чем больше активность полифенолоксидазы, тем меньше концентрация радиотоксинов и наоборот.