Экспресс-оценка содержания олеиновой и линолевой жирных кислот масла в измельченных семянках подсолнечника с помощью ИК-спектрометрии

Введение. Основная доля мирового производства семян подсолнечника приходится на обычный подсолнечник линолевого типа. При этом в последнее десятилетие, кроме традиционных типов, в ряде стран получили широкое распространение сорта как с повышенным (США), так и высоким (Франция, Испания, Венгрия, Украина и Российская Федерация) содержанием олеиновой кислоты масла. Наряду с этим, наблюдается увеличение мирового потребления высокоолеино-вого подсолнечного масла .

В России наибольшей популярностью пользуется традиционное подсолнечное масло. Оно обладает рядом технологических недостатков, связанных с особенностями жирно-кислотного состава. В последние годы в производство широко внедряются сорта и гибриды подсолнечника с высоким содержанием олеиновой кислоты в масле. Посевные площади высокоолеинового подсолнечника с каждым годом увеличиваются в связи с повышенным спросом на данный вид продукции.

Содержание олеиновой кислоты в подсолнечнике зависит от разных природных факторов, а также условий выращивания и посевного материала. Так, понижение температуры окружающей среды в период масло-образования и нарушение технологии при возделывании приводят к резкому снижению содержания олеиновой кислоты. Вследствие чего, на современном этапе высока роль контроля содержания олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника на всех стадиях его производства, начиная с качества товарной продукции, её заготовки, хранения и заканчивая переработкой на маслодобывающих предприятиях. Это всё имеет особо важное значение для предприятий, занимающихся селекцией и сортоиспытанием высокоолеи-новых сортов и гибридов подсолнечника [1]. В связи с этим авторами в данной работе обсуждается возможность экспресс-анализа содержания олеиновой кислоты в семенах подсолнечника на основе метода ядерно-магнитной релаксации.

Массовая оценка селекционного материала подсолнечника по содержанию олеиновой кислоты проводится в лаборатории биохимии ВНИИМК с помощью газожидкостной хроматографии. Этот метод очень точный, но дорогостоящий и требующий от исполнителей высокой квалификации и токсичных (метиловый спирт) химических реактивов.

Альтернативный метод оценки определения отдельных жирных кислот на современном этапе – использование спектральных приборов нового поколения, которые позволяют значительно удешевить исследования и увеличить производительность труда. Разработаны градуировочные модели для определения содержания олеиновой, линолевой и линоленовой жирных кислот в масле семян рапса для ИК-анализатора MATRIX–I фирмы Bruker Optics (Германия). Погрешность определения содержания искомых кислот не значительно превышает стандартный метод [2].

Для ИК-спетрометрии в последние годы были разработаны нормативные документы: ГОСТ Р 53600-2009 Семена масличные, жмыхи и шроты. Определение влаги, жира, протеина и клетчатки методом спектроскопии в ближней инфракрасной области [3], введенный с 2010 г., и после уточнения погрешностей определения и дополнения межгосударственный ГОСТ 32749-2014 с тем же названием, введенный с 2015 г. [4].

Однако о возможности использования ИК-спектрометрии для оценки содержания отдельных жирных кислот масла в семенах нормативной документации в открытой печати не найдено.

Поэтому была поставлена задача разработать градуировочные модели на ИК-анализа-торе по определению в измельченных семян- ках подсолнечника содержания олеиновой и линолевой жирных кислот масла.

Цель работы – создание экспресс-метода по определению содержания основных жирных кислот масла в измельченных семянках подсолнечника с помощью ИК-спектрометрии.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории биохимии на семянках подсолнечника, выращенных в 2015– 2018 гг. на центральной экспериментальной базе и в филиалах ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК.

Полученные семена подвергали тщательной очистке от сорной и масличной примесей. Сформированную пробу (20 г) в алюминиевых бюксах выдерживали в комнатных условиях от 3 до 10 дней. Это связано со стабилизацией семянок по влажности и температуре.

Определение состава жирных кислот масла измельченных семянок подсолнечника осуществляли по ГОСТ Р 51483-99 [5] и ГОСТ Р 51486-99 [6] с применением газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000» с автоматическим дозатором на капиллярной колонке SolGelWax 30 м × 0,25 мм × 0,5 мкм в токе газа – носителя гелия со скоростью 25 см/с, с программированием температуры в пределах 185–235 ºС.

Подготовленные пробы образцов семян измельчали в соответствии с ГОСТ 327492014 [4] и полученные спектры регистрировали в спектральном диапазоне 3500–12500 см-1 с разрешением 16 см-1, в соответствии с руководством на программное обеспечение (ПО) OPUS ИК-спектрометра MATRIX-I фирмы Bruker Optics (Германия). Спектры каждого образца регистрировали в трех повторностях с пересыпанием в кювете диаметром 51 мм (навеска 20–25 г).

Результаты и обсуждение. Процесс формирования партии образцов для построения модели определения основных жирных кислот в масле семян подсолнечника занял несколько лет. Это связано с тем, что на спектральные данные большое влияние оказывают условия, зона и год выращивания. Этот факт мы выявили при доработке градуировочных моделей по определению содержания олеиновой, линолевой и линоленовой кислот в масле семян рапса [2]. После добавления в градуировочную модель 25– 30 образцов нового урожая, погрешность определения значительно снижалась и составляла величину, полученную при начальной разработке.

Поэтому было отобрано 236 образцов семян подсолнечника за три года исследований с максимально возможным диапазоном варьирования содержания олеиновой кислоты – от 11,4 до 92,0 %, что позволило нам разработать устойчивую градуировочную модель, еще и разделив эту партию образцов пополам на калибровочные и тестовые. В результате анализа спектральных данных с помощью метода мультипликативной коррекции рассеяния в диапазоне от 6904 до 5400 см-1 была построена градуировочная модель San_51_C18_1 (рис. 1).

Рисунок 1 – График предсказанных значений содержания олеиновой кислоты в масле подсолнечника (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания олеиновой кислоты (Ось Х) градуировочной модели

San_51_C18_1

Данная модель имела относительно невысокий ранг (11) при достаточно высоком коэффициенте детерминации – 99,82. Среднеквадратичная погрешность предсказания (RMSEP) данной модели составила 1,23 %.

Показатель разработанной градуировочной модели RPD (Residual Prediction Deviation – значение остаточного отклонения предсказания для ранга, отображаемого на графике) оценивает устойчивость полученной зависимости. По оценке разработчиков программного обеспечения принято, что величина этого значения в пределах от 4,0 до 5,9 считается «хорошей», от 6,0 до 7,9 – «очень хорошей», а при значении более 10,0 рассматривается «как лучше чем референсный анализ».

Разработанная модель по определению содержания олеиновой кислоты в масле измельченных семянок подсолнечника имеет значение RPD 24.

Для испытания градуировочной модели была подобрана и проанализирована проверочная партия семян в том же диапазоне изменчивости признака, что и при разработке искомой зависимости (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительный анализ семянок подсолнечника по определению содержания олеиновой кислоты в масле

ЦЭБ ВНИИМК, 2018 г.

№ образца	Содержание олеиновой кислоты, %		Разница, %
	метод
	химический	спектральный	абсолютная	относительная
1	90,95	91,81	0,86	0,95
2	89,78	89,53	-0,25	0,28
3	88,79	90,72	1,93	2,17
4	87,42	88,74	1,32	1,51
5	86,17	86,41	0,24	0,28
6	84,26	84,82	0,56	0,66
7	81,86	81,93	0,07	0,09
8	80,67	78,89	-1,78	2,21
9	78,66	78,04	-0,62	0,79
10	72,32	71,76	-0,56	0,77
11	67,12	66,58	-0,54	0,80
12	58,65	57,72	-0,97	1,65
13	41,43	40,71	-0,74	1,79
14	39,44	37,40	-2,04	5,17
15	33,53	35,47	1,94	5,79
16	29,84	30,08	0,24	0,80
17	14,81	17,43	2,62	17,69
18	13,20	12,94	-0,26	1,97
Диапазон	13,20–90,95	12,94–91,81	-2,04–2,62	0,09–17,69
Среднее	63,27	63,39	0,97	2,52

Среднее значение отклонения определения содержания олеиновой кислоты составляет 0,97 % в абсолютных единицах из 18 проверочных образцов, относительная ошибка при средних значениях показателя превысила 15 % только у одного образца и в среднем составила 2,52 %. Хроматографический метод определения индивидуальных жирных кислот по показателю воспроизводимости допускает погрешность до 3 % абсолютных.

Таким образом, разработанная градуировочная модель San_51_C18_1 соответствует всем параметрам для качественной оценки семян подсолнечника на содержание олеиновой кислоты в масле, а также отличается высокой скоростью – более 100 образцов за рабочую смену. Однако необходимо отметить, что данный вид анализа должен выпол- няться двумя исследователями: один измельчает, тщательно перемешивает и готовит следующую пробу согласно ГОСТ 32749-2014, а второй проводит определение непосредственно на приборе MATRIX-I фирмы Bruker Optics.

Для повышения точности проводимых оценок по содержанию основных жирных кислот в масле семян подсолнечника необходимо построить также градуировочную модель по определению полиненасыщенной, эссенциальной линолевой кислоты. При сопоставлении содержания этих двух кислот можно выявить явные ошибки, так как их сумма должна быть около 90 %. При разработке данной градуировочной модели придерживались тех же методик и манипуляций, что и для олеиновой кислоты.

Диапазон изменчивости по содержанию линолевой кислоты в 236 образцах семян подсолнечника составил от 0,8 до 78,5 %. На основе разделения образцов на калибровочные и тестовые 50 на 50 калибровочная модель была построена на основании 354 спектров и проверялась независимым тестовым набором образцов.

Лучшая градуировочная модель по всем параметрам San_51_C18_2 представлена на рисунке 2.

Прогноз - Истинное / С18:2 [%] / Проверка тестового набора

Рисунок 2 – График предсказанных значений содержания линолевой кислоты в масле подсолнечника (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания линолевой кислоты (Ось X) градуировочной модели

San_51_C18_2

Коэффициент детерминации составил 99,89 при 10 рангах, а среднеквадратичная ошибка предсказания составила менее 0,9 % при высоком значении RPD – 29,8. Для испытания разработанной модели по определению содержания линолевой кислоты была проана-61

лизирована проверочная партия семян в том же диапазоне изменчивости, что и при разработке модели (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительный анализ семян подсолнечника по определению содержания линолевой кислоты в масле

ЦЭБ ВНИИМК, 2018 г.

№ образца	Содержание линолевой кислоты, %		Разница, %
	метод
	химический	спектральный	абсолютная	относительная
1	1,75	2,64	0,89	50,86
2	2,24	1,35	0,89	39,73
3	4,52	4,73	0,21	4,65
4	4,73	3,77	-0,96	20,30
5	5,09	5,78	0,69	13,56
6	6,71	6,80	0,09	1,34
7	7,95	7,51	-0,44	5,53
8	11,11	11,20	0,09	0,81
9	14,81	14,32	-0,49	3,31
10	18,27	18,41	0,14	0,77
11	19,75	19,74	-0,01	0,05
12	32,72	33,85	1,13	3,45
13	48,74	50,44	1,70	3,49
14	52,66	51,71	-0,95	1,80
15	59,89	60,00	0,11	0,18
16	72,10	72,26	0,16	0,22
17	74,21	74,03	-0,18	0,24
18	75,69	77,63	1,94	2,56
Диапазон	1,75–75,69	2,64–77,63	-0,96–1,94	0,05–50,86
Среднее	28,50	28,68	0,61	8,49

Так как существует высокая обратная корреляция между содержанием олеиновой и линолевой жирных кислот, то ранжирование образцов проверочной партии получилось от минимума к максимуму естественным образом. В абсолютных значениях ошибка определения единичных образцов колебалась в пределах от -1 до 2 %, однако в относительных единицах при низких значениях искомого показателя составила в одном образце более 50 %. В связи с этим средняя относительная погрешность составила 8,49 %. Среднее значение отклонения определения содержания линолевой кислоты – 0,61 % в абсолютных единицах. Применяя метод трех сигм, погрешность определения в 95 %х случаев не должна превышать 2,7 %, что не больше погрешности определения хроматографического метода. Получен достоверный результат экспресс оценки по определению содержания линолевой кислоты.

Полученная зависимость между истинными и прогнозируемыми значениями, рассчитанная по искомой модели для определения содержания линолевой кислоты в масле семян подсол- нечника, позволяет проводить оценку образцов с максимальной ошибкой менее 3 % в абсолютных единицах, что является сопоставимым с хроматографическим анализом.

Таким образом, получена градуировочная модель San_51_C18_2 по определению содержания линолевой кислоты в масле, позволяющая проводить экспресс-оценку селекционного материала измельченных семянок подсолнечника, являющаяся и лучшей моделью по сравнению с другими жирными кислотами.

После получения удовлетворительных значений погрешности определения по искомым жирным кислотам был разработан метод «Подсолнечник измельченный» в программе OPUS LAB для рутинного анализа по одновременному определению содержания олеиновой и линолевой кислот в масле семянок подсолнечника. Апробацию разработанного метода провели на 87 образцах отдельных са-моопыленных корзинок лаборатории селекции гибридного подсолнечника. После экспресс оценки образцов были отобраны пробы для уточнения и сравнения результатов с составом всех жирных кислот хроматографическим методом (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ семянок подсолнечника по содержанию олеиновой и линолевой кислот в масле при определении хроматографическим и ИК-спектрометри-ческим методами

ЦЭБ ВНИИМК, 2018 г.

Жирная кислота	№ 5	№ 6	№ 24	№ 25	№ 27	№ 64	№ 67
Метод газожидкостной хроматографии
Пальмитиновая	5,89	6,27	4,64	4,68	3,79	4,14	4,61
Пальми-толеиновая	0,17	0,18	0,16	0,11	0,14	0,10	0,08
Стеариновая	3,84	3,99	3,06	3,81	1,72	3,76	5,44
Олеиновая	48,99	45,96	89,19	76,60	90,95	79,39	76,39
Линолевая	39,05	41,75	0,98	12,81	1,90	10,53	10,79
Линоленовая	0,19	0,10	0,09	0,11	0,07	0,04	0,05
Арахино-вая	0,34	0,35	0,32	0,35	0,19	0,35	0,48
Эйкозено-вая	0,24	0,19	0,27	0,26	0,32	0,23	0,20
Бегеновая	0,88	0,84	0,88	0,94	0,56	1,08	1,49
Лигноце-риновая	0,41	0,37	0,41	0,33	0,35	0,37	0,47
Метод ИК-спектромет					рии
Олеиновая	48,7 (-0,19)	46,0 (0,04)	91,0 (1,81)	76,9 (0,3)	90,4 (-0,55)	80,7 (1,31)	76,6 (0,21)
Линолевая	38,8 (-0,25)	41,2 (-0,55)	1,0 (0,02)	13,0 (0,19)	1,4 (-0,5)	9,6 (-0,93)	11,6 (0,81)

Сравнительный анализ ИК-спектрометри-ческого c химическим методом показал сходимость результатов с минимальной погрешностью определения в пределах допустимой для хроматографического метода. При этом сравнительный анализ был проведен с минимальными навесками для ИК-спектрометрии с целью сохранения ценного селекционного материала.

Сравнительная характеристика входящих в метод «Подсолнечник измельченный» в программе OPUS LAB для рутинного анализа моделей по одновременному определению содержания олеиновой и линолевой кислоты представлена в таблице 4.

Талица 4

Характеристика градуировочных моделей по определению олеиновой и линолевой жирных кислот в масле семянок подсолнечника для ИК-спектрометрии* _________________ ЦЭБ ВНИИМК, 2018 г.

Компонент	Ранг	R2	RMSEP	RPD	Предобработка	Количество калибро-воч-ных спектров, шт.
Олеиновая	11	99,82	1,23	24,0	MSC	636
Линолевая	10	99,89	0,90	29,8	MSC	705

* Примечание – качество хемометрических моделей зависит от выбора правильного числа необходимых факторов, что также называется рангом модели; R² – коэффициент детерминации; RMSEP – среднеквадратичная погрешность предсказания; RPD – значение остаточного отклонения предсказания для ранга, отображаемого на графике; MSC – мультипликативная коррекция рассеяния

Выводы. Таким образом, в программе OPUS LAB создан метод «Подсолнечник измельченный» для массового анализа на основе разработанных градуировочных моделей по определению содержания олеиновой и линолевой жирных кислот в масле измельченных семянок подсолнечника в средней пробе (8–22 г) в кювете диаметром 51 мм. Это позволяет оперативно проводить предварительную оценку селекционного материала с высокой скоростью более 100 образцов за рабочую смену.