Экспресс-оценка содержания основных жирных кислот в масле семян рапса с помощью ИК-спектрометрии

Введение. В Краснодарском крае, как и во всем мире, производство рапса в современных условиях базируется на высокопродуктивных безэруковых и низко-глюкозинолатных сортах и гибридах, гарантирующих получение масла и шрота, соответствующих мировым стандартам качества [1].

В последнее время в селекции рапса на изменение состава жирных кислот во ВНИИМК достигнуты значительные успехи. В результате целенаправленного отбора биотипов ярового и озимого рапса на повышение содержания олеиновой и снижение линоленовой кислот были выделены селекционные номера со значительными изменениями по этим признакам. На государственное испытание в 2014 г. передан высокоолеиновый сорт рапса ярового Амулет. Отличительной особенностью этого сорта является высокое содержание олеиновой кислоты в масле – более 77 % при 67 % у стандарта [2].

Дальнейшее создание сортов рапса с высоким содержанием олеиновой и низким уровнем линоленовой кислот в сочетании с высокой масличностью, урожайностью, повышенной толерантностью к основным патогенам и выравненностью по высоте связано с проработкой большого объема селекционного материала по биохимическим признакам. Успешное выполнение селекционных работ на современном этапе предполагает исследование количественных и качественных показателей методами, способными оценить селекционный материал в малой навеске и без его разрушения. Этой задаче соответствует спектральный метод с помощью приборов нового поколения. Одним из таких приборов является ИК-анализатор MATRIX-I фирмы Bruker Optics (Германия), который позволяет оценивать показатели качества семян и масла в средней пробе. Преимущество метода ИК-спектрометрии заключается в следующем:

• -    высокая производительность проведения анализов;

• -    возможность одновременного определения различных показателей в одном образце, количество показателей ограничено только возможностями исследователя и целесообразностью их разработки;

• -    анализ проводится в средней пробе в стакане диаметром 97 мм (навеска 60–90 г), в стакане диаметром 51 мм (навеска 7–15 г) и в стаканчике диаметром 22 мм (навеска 2–3 г);

• -    сохранение целостности семян, что позволяет оценивать по этим показателям семена отдельных растений без потери их количества на анализ.

В связи с этим были проведены исследования, целью которых явилась разработка градуировочных моделей для ИК-анализатора MATRIX-I, позволяющая проводить экспресс-оценку содержания олеиновой, линолевой и линоленовой кислот масла семян рапса. Программой исследований были предусмотрены:

• -    подбор калибровочных образцов с максимально возможным диапазоном варьирования по содержанию олеиновой, линолевой и линоленовой кислот;

• -    разработка градуировочной модели для отдельного определения каждой искомой жирной кислоты;

• -    создание метода в программе для рутинного анализа с одновременным определением содержания трех жирных кислот;

• -    предварительная оценка разработанной градуировочной модели, её уточнение, проверка на селекционном материале и метрологическая оценка погрешностей;

• -    массовая оценка селекционного материала с целью отбора номеров с высоким содержанием олеиновой кислоты и последующим хроматографическим определением полного жирно-кислотного состава масла образцов семян.

Материалы и методы. Исследования проведены на семенах рапса озимого и ярового урожая 2014–2015 гг. в лаборатории биохимии ВНИИМК.

Хроматографический анализ проводили на газовом хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000» с автоматическим дозатором ДАЖ-2М на капиллярной колонке SolGelWax 30 м × 0,25 мм × 0,5 мкм в токе газа-носителя – гелия, со скоростью 22 см/с, с программированием температуры в пределах 178–230 оС. Получение метиловых эфиров и их хроматографирование выполняли в соответствии с нормативными методами [3; 4].

Спектры регистрировались в спектральном диапазоне 3500–12500 см-1 с разрешением 16 см-1, в соответствии с руководством на ПО OPUS.

Результаты и обсуждение. Для выполнения программы по градуировке ИК-анализатора подобрана партия из 68 об- разцов семян рапса с максимально возможным диапазоном варьирования по содержанию олеиновой кислоты в масле 61,7–82,7 %. Остаточное содержание эруковой кислоты во всех образцах не превышало 0,03 % от суммы жирных кислот.

Градуировочные спектры регистрировались с пересыпанием в трех повторностях в стаканчике диаметром 22 мм в режиме отражения (рис. 1).

Рисунок 1 – Результирующие спектры отражения 28 образов семян рапса

Неожиданный результат был получен при включении в калибровочную партию образцов с различным содержанием эруковой кислоты. В нашем исследовании было только два образца с содержанием 16,9 и 10,0 % эруковой и 35,2 и 47,7 % олеиновой кислот соответственно. Мы предполагали, что расширение диапазона изменчивости позволит получить более устойчивую градуировочную модель и уменьшение абсолютной погрешности определения олеиновой кислоты. Однако разница между предсказанными и «истинными» (хроматографическими) значениями составила в отдельных образцах более 17 %. Такой результат ставил под сомнение применимость данного метода для оценки содержания основных жирных кислот масла в целых семенах рапса в малой навеске (менее 3 г). На долю олеиновой, линолевой и линоленовой кислот в масле безэруковых семян рапса приходится от 92,0 до 93,5 % от суммы всех 13 кислот, поэтому для рапса они являются основными жирными кислотами.

Для получения градуировочной модели часть ИК-спектров исключали из таблицы стандартов из-за значительных отклонений от хроматографических данных, а также изменяли параметры вычисления множественной линейной регрессии (рис. 2).

Ранг: 5 RA2 = 97.7 RMSECV = 1.01 Bias:-0.000588 RPD: 6.6

Vai id ation No 16    Rape_22_C18_1 _2015-10-20. q2

Рисунок 2 – График предсказанных значений содержания олеиновой кислоты (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания олеиновой кислоты (Ось X) градуировочной модели «Rape_22_C18_1» для определения содержания олеиновой кислоты в масле семян рапса

Для оценки градуировочной модели «Rape_22_C18_1» была проанализирована проверочная партия семян в том же диапазоне изменчивости, что и при разработке модели (табл. 1).

Таблица 1

Проверка градуировочной модели «Rape_22_C18_1» для определения содержания олеиновой кислоты в масле семян рапса

ВНИИМК, 2015 г.

Образец	Содержание олеиновой кислоты, %		Разница, %
	хим. анализ	по «Rape_22_C18_1»	абсолютная	относительная
103	65,9	66,7	-0,8	1,21
105	80,5	79,6	+0,9	1,12
120	63,7	63,9	-0,2	0,31
124	68,5	68,9	-0,4	0,63
133	81,4	79,5	+1,9	2,33
136	73,6	72,6	+1,0	1,36
Диапазон	65,9–81,4	63,9–79,6	-0,8–1,9	0,31–2,33
Среднее	72,3	71,9	0,87	1,16

Ошибка определения содержания олеиновой кислоты в среднем составила 0,87 % абсолютных единиц, относитель- ная ошибка при высоких значениях показателя не превысила 3 % и составила в среднем 1,16 %.

Необходимо отметить, что согласно ГОСТ Р 51483-99 погрешность определения зависит от величины значения жирной кислоты и для значения более 5 % в категории воспроизводимости разница составляет 3 % абсолютных. Полученная зависимость между истинными и прогнозируемыми значениями позволяет оценивать селекционные образцы с максимальной ошибкой в 3 % абсолютных.

Диапазон изменчивости по содержанию линолевой кислоты из 68 образцов семян рапса составил 7–28 %. Лучшей градуировочной моделью по всем параметрам оказалась «Rape_22_C18_2» (табл. 2).

Таблица 2

Проверка градуировочной модели «Rape_22_C18_2» для определения содержания линолевой кислоты в масле семян рапса

ВНИИМК, 2015 г.

Образец	Содержание линолевой кислоты, %		Разница, %
	хим. анализ	по «Rape_22_C18_2»	абсолютная	относи тельная
82	7,6	7,4	+0,2	2,6
103	20,1	19,7	+0,4	2,0
120	21,1	21,5	-0,4	1,9
124	17,1	17,4	-0,3	1,7
133	7,1	8,0	-0,9	12,7
136	13,5	14,4	-0,9	6,7
Диапазон	7,1–21,1	7,4–21,5	-0,9–0,4	1,7–12,7
Среднее	14,4	14,7	0,52	4,60

Ошибка определения содержания линолевой кислоты в среднем составила 0,52 % абсолютных единиц, относительная ошибка при средних значениях показателя не превысила 15 % и составила в среднем 4,6 %. Полученная зависимость между истинными и прогнозируемыми значениями, рассчитанная по градуировочной модели «Rape_22_C18_2» для определения содержания линолевой кислоты в масле семян рапса, позволяет оценивать селекционный материал с максимальной ошибкой 3 % абсолютных.

Различия между калибровочными образцами по содержанию линоленовой кислоты были меньшими и составили от 3,5

до 8 %. Поэтому характеристика этой модели значительно уступает предыдущим (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика градуировочных моделей по определению олеиновой, линолевой и линоленовой кислот в масле семян рапса для ИК-спектрометрии

ВНИИМК, 2015 г.

Компонент	Ранг	* R2	* RMSECV	Предобработка	Спектральный диапазон	Количество калибровочных спектров
Олеиновая	6	97,7	1,01	Первая производная + векторная нормализация	9002,5–5400	200
Ли-нолевая	10	96,9	0,937	Первая производная + MSC	9002,5–4179,4	204
Лино-лено-вая	10	92,8	0,286	Первая производная + MSC	9002,5–4590	196

*Качество хемометрических моделей зависит от выбора правильного числа необходимых факторов, что также называется рангом модели.

R ² – коэффициент детерминации. RMSECV – среднеквадратичная погрешность предсказания при перекрестной проверке. MSC – мультипликативная коррекция рассеяния.

Однако полученная зависимость «Rape_22_C18_3» по оценке содержания линоленовой кислоты показывает, что она адекватно оценивает искомый показатель (табл. 4).

Таблица 4

Проверка градуировочной модели «Rape_22_C18_3» для определения содержания линоленовой кислоты в масле семян рапса

ВНИИМК, 2015 г.

Образец	Содержание линоленовой кислоты, %		Разница, %
	хим. анализ	по «Rape_22_C18_2»	абсолютная	относительная
103	6,3	6,4	-0,1	1,6
120	7,1	7,0	+0,1	1,4
124	7,7	6,9	+0,8	10,4
133	5,0	4,9	+0,1	2,0
136	6,3	5,9	+0,4	6,3
Диапазон	5,0–7,7	4,9–7,0	-0,1–0,8	1,4–10,4
Среднее	6,48	6,22	0,30	4,34

В среднем ошибка определения содержания линоленовой кислоты составляет около 0,3 % абсолютных единиц, однако относительная ошибка при низких значениях показателя не превысила 15 % и в среднем составила 4,34 %. В целом она дополняет общую картину по содержанию основных жирных кислот.

Для большей наглядности в таблице 5 приведены данные химического анализа и расчетные по градуировочной модели содержания основных жирных кислот. Сопоставление значений трех кислот позволит, опираясь на практическую особенность различных биотипов, однозначно сделать выбраковку образцов. После этого оставшиеся образцы анализируют точным хроматографическим методом для получения полной информации по всем кислотам.

Таблица 5

Сравнительные данные химического анализа и расчетные по градуировочной модели содержания основных жирных кислот масла семян образов рапса

ВНИИМК, 2015 г.

№ образца	Жирная кислота	Содержание кислот, %
		хим. анализ	по «Rape_22_C18_2»
	Олеиновая	65,9	66,7
103	Линолевая	20,1	19,7
	Линоленовая	6,3	6,4
	Олеиновая	81,4	79,5
133	Линолевая	7,1	8,0
	Линоленовая	5,0	4,9
	Олеиновая	73,6	72,6
136	Линолевая	13,5	14,4
	Линоленовая	6,3	5,9

После получения удовлетворительных значений погрешности определения по всем трем жирным кислотам был разработан метод в программе OPUS LAB для рутинного анализа по одновременному определению содержания олеиновой, линолевой и линоленовой кислот.

Для оценки надежности получения результатов в программе OPUS LAB были проанализированы семена рапса ярового урожая 2014 г. с известными значениями (табл. 6).

Таблица 6

Сравнительные данные химического анализа и расчетные по градуировочной модели содержания основных жирных кислот масла семян образов рапса

ВНИИМК, 2015 г.

№ образца	Жирная кислота	Содержание кислот, %
		хим. анализ	по «Rape_22_C18_2»
	Олеиновая	78,7	80,1
467	Линолевая	10,4	11,0
	Линоленовая	3,6	3,8
	Олеиновая	66,5	66,2
468	Линолевая	18,3	20,3
	Линоленовая	7,8	6,5
	Олеиновая	72,7	71,0
471	Линолевая	12,8	16,1
	Линоленовая	7,5	5,5

Таким образом, разработаны градуировочные модели для определения содержания основных жирных кислот в масле семян рапса в малой навеске в малом стаканчике диаметром 22 мм. Это позволяет оперативно проводить предварительную оценку селекционного материала с высокой скоростью – более 100 образцов за рабочую смену, а также контролировать жирно-кислотный состав отдельных растений.

В дальнейшем будет разработана градуировочная модель по определению масличности и содержания глюкозинола-тов, что значительно увеличит объем анализируемого селекционного материала и повысит его информативность.