Электрофорез белков биоконсервированной крови

Одним из интенсивных путей расходования компонентов аминокислотного пула организма является синтез белков плазмы крови, принимающих участие в поддержании рН, вязкости, коллоидноосмотического давления, уровня катионов крови, транспорте гормонов, липидов, жирных кислот, пигментов, жирорастворимых витаминов, свертывании крови, иммунных и других процессах.

Плазма крови содержит свыше 300 белков. Большинство белков плазмы - гликопротеины, количество углеводных компонентов в их составе варьирует от 1%, например, в альбуминах до 40% - а 1 -глобулинах. Белки плазмы содержат дисульфидные связи и небольшое количество свободных тиоловых (-SH) групп: предполагают, что это имеет большое значение для предотвращения денатурации белков в плазме, которая возможна вследствие высокого парциального давления кислорода.

Исследования белков плазмы организма, кроме специфической нозологической информации, дают определенное представление о состоянии белкового обмена в целом. Исследованию подлежат количественные и качественные характеристики белкового состава плазмы.

Концентрация белков плазмы определяется тремя основными факторами: скоростью синтеза, скоростью метаболизма и объемом жидкости, в котором распределены белки.

В настоящее время различными методами можно получить от 5 до 100 фракций белков плазмы [1].

С помощью электрофореза выделяют 6 стандартных фракций: альбумины и четыре фракции глобулинов (α 1 -, α 2 -, β 1 -, β 2 -, и γ- ). Соотношение этих основных белковых фракций в сыворотке крови следующее (%): альбумин – 56-60, α 1 -глобулин – 4-5, α 2 -глобулины - 8, β-глобулины – 12, фибриноген – 4, γ- глобулины – 16 [2].

Каждая фракция содержит многочисленные индивидуальные белки, среди которых имеются белки как свертывающей, так и противосвертывающей систем.

Цель работы: исследование влияния компонентов молочной сыворотки на белковую систему биоконсервированной крови.

Задачи эксперимента:

• 1.    Провести электрофоретические исследования динамики состояния биоконсервированной крови в динамике хранения.

• 2.    Установить наличие изменений в белковой системе биоконсервированной крови.

• 3.    Сделать сравнительный анализ протеинограмм молочной сыворотки, биоконсервированной и стабилизированной крови.

Объекты исследования: Кровь, стабилизированная фосфатами (КСФ), биоконсервированная кровь (БК), высококислотная молочная сыворотка (МС), полученная в результате ферментирования обезжиренного молока культурой Lactobacillus acidophilus.

Методы исследования: электрофоретические исследования проводили на автоматическом анализаторе крови и ее компонентов фирмы Cormay [3].

Результаты эксперимента . БК получали путем смешивания изъятой из кровеносных сосудов крови убойных животных с ферментированной сывороткой. Стабилизированную таким образом кровь хранили в течение 20 суток при температуре плюс 4 – плюс 6⁰С. Результаты электрофоретических исследований белковой системы биоконсервированной крови представлены в таблице 1 и на рисунках 1-6.

Из таблицы 1 и рисунков 1,2,3,4,5 видно, что фракции альбуминов, α 1 -, α 2 -, β 2 -, γ- глобулинов имеют тенденцию к уменьшению. В данном случае возможен протеолиз белков собственными ферментами. Вероятно, и молочная кислота оказывает определенное влияние на распределение белковых фракций.

В норме альбумин синтезируется в печени и его период полураспада составляет около 20 суток. Следовательно, постепенное уменьшение фракции альбуминов в изучаемой системе связано с отсутствием процессов пополнения их пула (процессов синтеза) и воздействием молочной кислоты, что существенно влияет на скорость их естественного распада.

Таблица 1

Изучение белковых фракций БК в процессе хранения при 4 - 6ºС

Наименование фракции	Содержание белковых фракций, г/л
	МС	КСФ	БК, сроки хранения, сут
			0	6	13	17	20
1	2	3	4	5	6	7	8
альбумины	1,25±0,21	5,6±0,55	12,36± 0,91	11,40± 1,10	3,51± 0,59*	2,78± 0,55*	0,02± 0,01*
α1-глобулины	0,52±0,020	0,08±0,01	5,61± 0,78	1,11± 0,18*	0,10± 0,02*	0,13± 0,02*	0,66± 0,07*
α2-глобулины	0,25±0,050	0,44±0,06	6,67± 0,32	1,79± 0,06*	11,7± 0,64*	0,65± 0,07*	0,29± 0,075*
β1-глобулины	0,38± 0,040	15,97±2,72	5,3± 1,05	2,02± 0,016*	14,2± 0,38*	29,2± 5,40*	38,13± 0,88*
β2-глобулины	1,07± 0,025	68,90±8,90	21,9± 3,89	2,36± 0,36*	1,27± 0,09*	1,56± 0,16*	1,10± 0,13*
γ- глобулины	1,86±0,56	6,35±2,30	10,6± 10,36	9,66± 1,62	1,70± 0,25*	2,70± 0,09*	2,77± 0,29*
белок	5,3±0,18	97,40±11,12	62,1± 11,9	28,40± 1,50*	32,5± 2,90*	37,0± 1,17*	46,20± 1,80*

Обозначение: * - достоверно при р ≤ 0,05

время, сут ал ьбумины

Рис. 1. Изменения содержания альбуминов в БК в процессе хранения при t =4 - 6˚С

Анализируя данные таблицы 1, можно обнаружить наличие в процессе хранения белковой системы БК локального увеличения α 1 -глобулинов (рис. 3) и стабильного возрастания - β 1 -глобулинов (рис. 4). Вместе с тем параллельно наблюдается общая тенденция изменения фракций α 1 -, α 2 -глобулинов в сторону уменьшения.

Учитывая тот факт, что кровь в присутствии молочной сыворотки не свертывается, можно предположить образование комплексов между белками фракций α 1 -, α 2 -глобулинов, а именно α 1 -антитрипсином и α 2 -макроглобулином, с плазминогеном.

Рис. 2. Изменения содержания α 1 -глобулинов в БК в процессе хранения при t =4 - 6˚С

Кроме того, известно, что в состав а 1 -глобулинов входят гаптоглобины, которые составляют 25% от всего их содержания. Эта группа белков плазмы крови связывает свободный гемоглобин с образованием комплексов. В живых организмах данный комплекс метаболизируется в ретикуло-эндотелиальной системе, что необходимо для предотвращения потерь железа и повреждения почек гемоглобином [1]. Следовательно, низкие уровни α 1 -глобулинов могут быть обусловлены также снижением в их составе гаптоглобинов, которые при гемолизе связывают гемоглобин. Наличие гемолиза в изучаемой системе обнаружено на 4-е сутки.

Резкое увеличение α 2 -глобулинов (рис. 3) на 13-е сутки хранения, возможно, связано и с автолизом клеток Lactobacillus acidophilus. Снижение клеток Lactobacillus acidophilus установлено на 5-е сутки.

Рис. 3. Изменения содержания α 2 -глобулинов в БК в процессе хранения при t =4-6˚С

Как уже указывалось выше, в процессе хранения имеет место стабильное увеличение содержания только фракции β 1 - глобулинов (рис. 4).

Рис.4. Изменения содержания β 1 -глобулинов в БК в процессе хранения при t =4 - 6˚С

К фракциям β 1 -глобулинов относятся трансферрин, гемопексин [4], которые характеризуют интенсивность процессов распада гемоглобина. Так, in vivo гемопексин (β-глобулин) связывает гем и предотвращает его выделение почками. Сродство гемопексина к гему значительно выше, чем у альбумина. Комплекс гем-гемопексин поступает из крови в печень, где освобождается Fe³⁺ для образования гемоглобина [1]. Трансферрин, связывая свободный гем, также поступает на деструкцию или ресинтез гемоглобина. То есть накопление и устойчивость гем- β-глобулиновых комплексов также способствует высокому уровню данной фракции (β 1 -глобулинов) к 20 суткам хранения БК.

Снижение фракции β 2 - глобулинов (рис. 5) согласуется с результатами проведенных исследований коагуляционной и фибринолитической систем БК [5], которые показали достоверное уменьшение содержания основного белка свертывания крови - фибриногена. Данный белок имеет заряд и молекулярную массу, позволяющие отнести его к фракциям β 2 - глобулинов.

в2-глобулины

Рис. 5. Изменения содержания β 2 -глобулинов в БК в процессе хранения при t=4-6˚С

Наиболее значительная в количественном отношении фракция белков молочной сыворотки – это фракция иммуноглобулинов. Снижение исходного содержания γ- глобулинов молочной сыворотки и БК в процессе хранения свидетельствует, вероятно, об их связывании с антигенными детерминантами клеток крови и последующей биодеградации комплексов (рис. 6).

y-глобулины

Рис. 6. Изменения содержания γ -глобулинов в БК в процессе хранения при t =4 - 6˚С

Таким образом, исследования электрофоретической подвижности белков БК показали следующие изменения белкового профиля: уменьшение альбуминов и большинства глобулиновых фракций, за исключением фракции β 1 -глобулинов, которая претерпевает резкое избирательное увеличение.

Выводы

• 1.    Определена динамика распределения общего белка биоконсервированной крови по отдельным белковым фракциям.

• 2.    Установлено изменение профиля электрофореграмм биоконсервированной крови под действием компонентов высококислотной сыворотки.

• 3.    Показано наличие процессов комплексообразования и денатурации белков биоконсервирован-ной крови.