Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактерий-антагонистов из рода Bacillus

Введение. В лаборатории биометода ФГБНУ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий-продуцентов микробиопрепаратов – биофунгицидов. Разрабатываются технологии производства и применения разных препаративных форм микробиопрепаратов [1].

Ранее нами были разработаны препаративные формы микробиопрепаратов жидкая культура, паста и порошок на основе твёрдых носителей – питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита. Но жидкие культуры и пасты выдерживали хранение не более 10 дней и 3-х месяцев соответственно, даже в холодильнике, а порошки плохо смачивались в воде и забивали отверстия опрыскивателей [2]. Поэтому в последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения биопрепаратов без снижения титра, в форме, образующей в воде однородные суспензии.

В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок (СП) при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде перспективного бактериального штамма-продуцента D 71 Bacillus subtilis из коллекции лаборатории биометода.

Материалы и методы. Для отработки элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus нарабатывались лабораторные образцы в препаративной форме смачивающийся порошок. Для этого штамм-продуцент D 7-1 Bacillus subtilis выращивали поверхностным способом на жидкой питательной среде Тайлона 3 [3] при оптимальной температуре 28–30 ^ȯС, в трёхлитровых стеклянных баллонах, с объёмом питательной среды 500 мл. Выращенную биомассу бактерии отделяли сливом надосадочной жидкости с предварительным охлаждением при температуре + 2 ^ȯС. Затем к биомассе добавляли при-липатель, растекатель и наполнитель. Всё перемешивали, высушивали под вытяжкой при температуре 25–28 ^ȯС и размалывали на мельнице с охлаждением. Титр порошка определяли микробиологическим способом [4].

Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования бактериальный штамм-продуцент выращивали в течение 10, 15 и 20 суток, с предварительным добавлением двух процентов его глубинной культуры к объёму питательной среды. Определяли вес порошка и титр. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста. Сроки хранения опытных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от упаковки, температуры, стабилизаторов и фотопротекторов. Опытные образцы хранили в банках с притертой крышкой и в бумажных пакетах, при постоянных (+30 и -18 ȯС) и переменной (+24 – +26 ȯС) температурах.

Испытывали стабилизаторы: резорцин (0,1; 0,2 %), тиомочевину (0,05;

0,1  %), аскорбиновую кислоту (0,05;

0,1 %), бензоат натрия (0,1; 0,5 %), сульфат меди (0,05 %), гумат натрия (0,5;

2,0 %) и гидрохинон (0,1; 0,2 %); фотопротекторы: уголь активированный (0,5; 1,0; 4,0 %) и двуокись титана (1,0; 10,0 %), при переменной температуре +24 –+26 ȯС. Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарата определяли титр.

Результаты и обсуждение . Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой питательной среде Тайлона 3 и объём посевной суспензии бактериального штамма-продуцента (табл. 1).

Таблица 1

Влияние срока поверхностного культивирования на жидкой питательной среде и объёма посевной суспензии бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата D 7-1 Bacillus subtilis на массу смачивающегося порошка и титр опытных образцов микробиопрепарата г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Вариант	Объём посевной суспензии, %	Срок культивирования, сутки
		10		15		20
		масса СП, г	титр, КОЕ/г	масса СП, г	титр, КОЕ/г	масса СП, г	титр, КОЕ/г
D 7-1	2,0	12,6	1,1 × 108	27,9	5,9 × 108	27,7	1,9 × 108
	4,0	16,08	1,4 × 108	28,5	3,7 × 108	23,6	4,8 × 108

Максимальная масса СП получена через 15 и 20 суток культивирования D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой питательной среде; она не зависела от объёма посевной суспензии (2 и 4 %): 27,9–28,5 г и 27,7–23,6 г соответственно против 12,6– 16,8 г с 500 мл питательной среды, при сроке выращивания 10 суток. Титр СП не зависел от сроков культивирования и объёма посевной суспензии штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариантах выращивания (1,1–5,9 × 10⁸ КОЕ/г).

Таким образом, оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой среде Тайлона 3 составил 15 суток, оптимальный объём посевной суспензии – 2,0 % к объёму питательной среды.

Установлены сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата D 7-1 Bacillus subtilis в препаративной форме СП в зависимости от упаковки и температуры хранения (табл. 2).

Таблица 2

Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis в процессе хранения г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г
	+24 –+26 ȯС		+30 ȯС		- 18 ȯС
	пакет	банка	пакет	банка	пакет	банка
Через 3 месяца	3,3 × 108	3,8 × 108	3,1 × 108	2,4 × 108	1,4 × 108	1,5 × 108
Через 6 месяцев	2,0 × 108	2,1 × 108	2,7 × 108	1,9 × 108	1,1 × 108	1,1 × 108
Через 9 месяцев	1,7 × 108	1,5 × 108	1,4 × 108	1,5 × 108	9,0 × 108	9,2 × 107
Через 12 месяцев	1,0 × 108	3,4 × 108	2,1 × 108	8,2 × 108	2,5 × 108	8,0 × 107

Установлено, что при всех условиях хранения опытных образцов микробиопрепарата в пакетах и банках в течение 12

месяцев титр сохранялся на первоначальном уровне (10⁸ КОЕ/г). Исключением был вариант хранения СП при низкой температуре ( - 18 ^оС) в банках, где титр незначительно снизился до 8,0–9,2 × 10⁷ КОЕ/г через 9 и 12 месяцев хранения. Особенно следует отметить, что в отличие от микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов [5] исходный титр сохранялся и в варианте хранения опытного образца при постоянной высокой температуре (+30 ^оС) и особенно при хранении в банках (8,2 × 10⁸ КОЕ/г).

Определяли влияние стабилизаторов и фотопротекторов на сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе     бактериального     штамма- продуцента D 7-1 Bacillus subtilis в препаративной форме СП в бумажных пакетах при переменной температуре (табл. 3).

Таблица 3

Влияние стабилизаторов и фотопротекторов на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis через двенадцать месяцев хранения при переменной температуре от +24 до +26 ȯС г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г, через, месяцев
	3	6	9	12
Контроль	3,3 × 108	2,0 × 108	1,7 × 108	1,0 × 108
Резорцин 0,1	4,8 × 108	4,0 × 108	3,8 × 108	2,8 × 108
Резорцин 0,2	3,0 × 108	3,1 × 108	3,0 × 108	2,4 × 108
Тиомочевина 0,05	8,4 × 108	3,0 × 107	2,0 × 107	1,5 × 107
Тиомочевина 0,1	8,0 × 108	4,3 × 107	2,0 × 107	1,8 × 107
Аскорбиновая кислота 0,05	4,5 × 108	1,2 × 108	1,0 × 108	1,0 × 108
Аскорбиновая кислота 0,1	4,4 × 108	1,0 × 108	1,0 × 108	1,0 × 108
Бензоат натрия 0,1	2,4 × 108	9,8 × 107	8,0 × 107	8,0 × 107
Бензоат натрия 0,5	1,3 × 108	6,4 × 107	5,0 × 107	6,4 × 107
Сульфат меди 0,005	2,3 × 108	3,4 × 107	2,0 × 107	2,0 × 107
Гидрохинон 0,1	3,7 × 108	6,8 × 107	5,0 × 107	4,8 × 107
Гидрохинон 0,5	4,1 × 108	6,8 × 107	2,0 × 107	2,0 × 107
Гумат 0,5	1,7 × 108	3,1 × 107	2,0 × 107	1,8 × 107
Гумат 2,0	1,8 × 108	3,4 × 107	1,0 × 107	1,0 × 107
Меласса 0,3	2,5 × 108	1,5 × 107	1,0 × 107	1,0 × 107
Меласса 0,5	2,7 × 108	6,3 × 107	2,0 × 107	2,0 × 107
Двуокись титана 1,0	1,4 × 108	6,4 × 107	3,0 × 107	2,8 × 107
Двуокись титана 10,0	1,4 × 108	5,5 × 107	2,8 × 107	2,4 × 107
Уголь активированный 0,5	2,3 × 108	8,6 × 107	2,0 × 107	2,0 × 107

В контроле без добавок титр микробиопрепарата при хранении в бумажном пакете в условиях переменной температуры от +24 до +26 оС в течение 12 месяцев сохранился на исходном уровне (1,0– 3,3 × 108 КОЕ/г). При добавлении стабилизаторов и фотопротекторов титр сохранился на исходном уровне в вариантах с резорцином и аскорбиновой кислотой (1,0–2,8 × 108 КОЕ/г). В остальных вариантах титр даже снизился до 107 КОЕ/г, но в варианте с бензоатом натрия – с высоким основанием (6,4–8,0 × 107 КОЕ/г).

Таким образом установлено, что для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus с исходным титром в течение 12 месяцев добавление стабилизаторов нецелесообразно.

Заключение. Оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой среде Тайлона 3 составил 15 суток, а объём посевной суспензии – 2,0 % к объёму питательной среды. При всех условиях хранения опытных образцов микробиопрепарата в пакетах и банках в течение 12 месяцев титр сохранялся на первоначальном уровне (10⁸ КОЕ/г). Исключением был вариант хранения СП при низкой температуре ( - 18 ^ȯС) в банках, где титр незначительно снизился – до 8,0–9,2 × 10⁷ КОЕ/г, через 9 и 12 месяцев хранения. В отличие от микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов исходный титр сохранялся и в варианте хранения опытного образца при постоянной высокой температуре (+30 ^оС), особенно при хранении в банках (8,2 × 10⁸ КОЕ/г). Для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus с исходным титром в течение 12 месяцев добавление стабилизаторов нецелесообразно.