Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме "смачивающийся порошок" на основе смеси перспективных штаммов-продуцентов из родов Penicillium и Bacillus

Введение. В лаборатории биометода ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий продуцентов микробиопрепаратов – биофунгицидов. Разрабатываются технологии производства и применения разных препаративных форм микробиопрепаратов [1]. Разработаны препаративные формы микробиопрепаратов «жидкая культура», «паста» и «порошок» на основе твёрдых носителей – питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита [2]. В последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения микробиопрепаратов без снижения титра, с минимальной нормой расхода, образующих в воде однородные суспензии. Разрабатывается препаративная форма «смачивающийся порошок» (СП) при поверхностном культивировании отдельных штаммов-продуцентов на жидких питательных средах.

Ранее нами проведены исследования по отработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме СП при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективных грибных штаммов-продуцентов из рода Penicillium [3], бактерий из рода Bacillus [4] и Pseudomonas [5].

С целью расширения спектра действия микробиопрепаратов устанавливали возможность получения смесевых препаратов в препаративной форме СП на основе нескольких штаммов-продуцентов. В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства и хранения лабораторных образцов смесе-вого микробиопрепарата в препаративной форме СП на основе перспективных бактериального (Б-12 Bacillus licheniformis ) и грибного (PK-1-3 Penicillium vermicu-latum ) штаммов-продуцентов.

Материалы и методы. Определение совместимости штаммов-продуцентов микробиопрепарата PK-1-3 Penicillium vermiculatum и Б-12 Bacillus licheniformis проводили методом двойных (встречных) культур на агаризированных средах – картофельно-сахарозном агаре (КСА) и Тайлона-3 [6]. В чашки Петри (ЧП) высевали агаровые блоки с мицелием гриба и бактериальной плёнкой на расстоянии 6 см друг от друга. Культуры инкубировали в течение 15 дней при температуре +25,0 °С. Контрольные варианты – чистые культуры гриба и бактерии, посеянные отдельно. Учеты проводили ежедневно. Отмечался характер взаимоотношений гриба и бактерии: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия гриба и бактериальной плёнки бактерии.

Штаммы-продуценты PK-1-3 Penicil-lium vermiculatum и Б-12 Bacillus licheniformis выращивали поверхностным способом на жидких питательных средах (Рудакова [7] и Тайлона-3 соответственно) отдельно и совместно на каждой среде, при оптимальных температурах (27 и 30 оС соответственно) в трёхлитровых стеклянных баллонах, с объёмом питательной среды 500 мл. Выросшую биомассу, как отдельно каждого штамма-продуцента, так и при совместном выращивании, отделяли сливом культуральной жидкости. Затем к биомассе добавляли прилипатель, растекатель и наполнитель. Всё перемешивали, распределяли тонким слоем на гладкой поверхности, высушивали под вытяжкой при температуре 25–28 оС до влажности 6–7 % и размалывали на мельнице с охлаждением. Влажность образцов определяли стандартным методом, высушиванием до постоянной массы (ГОСТ 5180-2015) [8]. Второй вариант получения смесевого препарата заключался в смешивании СП, полученных из отдельно выращенных штаммов-продуцентов, в соотношении 1 : 1.

Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования на жидкой питательной среде грибной и бактериальный штаммы-продуценты выращивали в течение 10 и 15 суток, с предварительным добавлением 2 % глубинной культуры продуцентов к объёму питательной среды. Определяли вес порошка и титр.

Сроки хранения лабораторных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от температуры. Лабораторные образцы хранили в пакетах из крафт бумаги с доступом воздуха, при постоянных (+30 и -18 оС) и переменной (+24…+26 оС) температурах. Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарата определяли титр микробиологическим способом [9]. Титр гриба-продуцента определяли на среде КСА, бактерии – на среде Тайлона-3. Определение числа колониеобразующих единиц этим методом включало три этапа: приготовление разведений, посев на питательную среду в ЧП и подсчет выросших колоний. Затем 1,0 г исследуемого порошка переносили в колбу с 99,0 мл стерильной воды и встряхивали на качалке 20 минут. Для приготовления    разведений    стерильную водопроводную воду разливали по 9,0 мл в стерильные сухие пробирки. Затем отбирали 1,0 мл суспензии и переносили в пробирку с 9,0 мл стерильной воды. Полученное разведение тщательно перемешивали, несколько раз вбирая в дозатор и выпуская из него полученную суспензию клеток. Таким же образом готовили все последующие разведения. Высев исследуемой суспензии осуществляли поверхностным (для гриба) и глубинным (для бактерии) способом. При поверхностном способе по 0,1 мл из соответствующего разведения переносили в три стерильные ЧП на агаризированную питательную среду (КСА) и тщательно растирали шпателем. При глубинном способе по 1,0 мл из соответствующего разведения переносили в три стерильные ЧП. Затем заливали в чашки по 15,0–20,0 мл среды, расплавленной и остуженной до +45,0…+50,0 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Колонии антагонистов подсчитывали через 5– 7 суток инкубации. Количество колониеобразующих единиц в 1,0 г исследуемого порошка вычисляли по формуле:

„ ax · 10ⁿ Т =        ,

, где Т – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 г;

a – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

V – объем суспензии, взятый для посева;

10n – коэффициент разведения.

Результаты и обсуждение. Определена совместимость штаммов-продуцентов микробиопрепарата PK-1-3 Penicillium vermiculatum и Б-12 Bacillus licheniformis методом двойных (встречных) культур на агаризированных средах. Установлено, что на нейтральной питательной среде КСА гриб и бактерия росли, не мешая друг другу. Тогда как на специализированной для бактерии среде Тайлона-3 бактерия занимала бóльшую часть поверхности питательной среды и подавляла рост гриба-продуцента (рис. 1).

а б

Рисунок 1 – Совместное культивирование грибного PK-1-3 Penicillium vermiculatum и бактериального Б-12 Bacillus licheniformis штаммов-продуцентов микробиопрепарата на агаризированных питательных средах:

а – Тайлона-3; б – КСА (ориг.)

При раздельном поверхностном культивировании на жидких питательных средах (Рудакова и Тайлона-3) каждый штамм образовывал сплошную толстую мицелиальную и бактериальную плёнки. Лабораторные образцы микробиопрепаратов в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании каждого штамма на жидкой питательной среде, образовывали в воде стойкую суспензию, исходный титр препаратов на основе гриба составил 1010 КОЕ/г, а на основе бактерии – 1012 КОЕ/г. Влажность лабораторных образцов СП микробиопрепаратов составляла 6,0–7,1 %.

Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования на жидких питательных средах отдельно для грибного и бактериального штаммов-продуцентов (табл. 1).

При поверхностном культивировании PK-1-3 Penicillium vermiculatum на жидкой питательной среде Рудакова максимальная масса СП получена через 15 суток. Титр СП не зависел от сроков культивирования грибного штамма-продуцента и был одного порядка в обоих вариантах выращивания (5,8–6,1 × 109 КОЕ/г).

Таблица 1

Влияние срока поверхностного культивирования на жидких питательных средах грибного PK-1-3 Penicillium vermiculatum и бактериального Б-12 Bacillus licheniformis штаммов-продуцентов на массу смачивающегося порошка и титр лабораторных образцов микробиопрепаратов г. Краснодар, ВНИИМК, 2018 г.

Вариант	Объём посевной суспензии, %	Срок культивирования, сутки
		10		15
		Масса СП, г	Титр, КОЕ/г	Масса СП, г	Титр, КОЕ/г
PK-1-3	2,0	8,1	6,1 × 109	11,3	5,8 ×109
Б-12	2,0	3,7	3,7 ×1012	3,7	2,9 × 1012

Оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма-продуцента Б-12 Bacillus licheniformis составил 10 суток, так как с увеличением срока культивирования масса СП не увеличивалась, а титр был одного порядка в обоих вариантах выращивания (2,9–3,7 × 10¹² КОЕ/г).

Таким образом, оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма РК-1-3 Penicillium vermiculatum на жидкой среде Рудакова составил 15 суток. Для бактериального штамма Б-12 Bacillus licheniformis -3 оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой среде Тайлона-3 составил 10 суток.

При совместном поверхностном культивировании на обеих жидких питательных средах бактерия занимала всю поверхность питательной среды, образовывала толстую бактериальную плёнку и подавляла рост колонии гриба, даже на специализированной для гриба среде Рудакова (рис. 2).

Изготовленные лабораторные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при совместном поверхностном культивировании грибного и бактериального штаммов на обеих 113

жидких питательных средах образовывали в воде стойкую суспензию, но имели исходный титр препарата только на основе бактерии 1010 КОЕ/г, который был на два порядка меньше, чем в лабораторном образце СП, полученном на основе отдельного бактериального штамма.

а                 б

Рисунок 2 – Совместное поверхностное культивирование грибного PK-1-3 Penicillium vermiculatum и бактериального Б-12 Bacillus licheniformis штаммов-продуцентов микробиопрепарата на жидких питательных средах: а – Тайлона-3; б – Рудакова (ориг.)

Таким образом, установлена нецелесообразность совместного поверхностного культивирования исследованных грибного и бактериального штаммов-продуцентов микробиопрепарата на жидких питательных средах.

Определяли сроки хранения лабораторных образцов микробиопрепаратов, полученных из отдельно выращенных штаммов-продуцентов в условиях переменной температуры (+24…+26 оС) в бу- мажных пакетах с доступом воздуха (табл. 2), а также смесевого препарата, полученного при смешивании СП на основе отдельных штаммов в соотношении 1 : 1, в зависимости от температуры (табл. 3).

Установлено, что при хранении лабораторных образцов СП микробиопрепаратов, полученных из отдельно выращенных штаммов-продуцентов, в условиях переменной температуры +24…+26 оС, титр бактериального препарата через 12 месяцев сохранился на исходном уровне, тогда как у грибного – снизился на порядок, но сохранялся высоким (1,5 × 1012 и 2,5 × 109 КОЕ/г соответственно).

Таблица 2

Влияние сроков хранения лабораторных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе отдельно выращенных грибного PK-1-3 Penicillium vermiculatum и бактериального Б-12 Bacillus licheniformis штаммов-продуцентов на титр г. Краснодар, ВНИИМК, 2018 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г, через, месяцев
	1	3	6	9	12
PK-1-3	2,8 × 1010	1,5 × 1010	8,5 × 109	6,8 × 109	2,5 × 109
Б-12	3,7 × 1012	6,5 × 1012	4,3 × 1012	2,8 × 1012	1,5 × 1012

Таблица 3

Влияние температуры на титр лабораторного образца смесевого микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе смеси грибного PK-1-3 Penicillium vermiculatum и бактериального Б-12 Bacillus licheniformis штаммов-продуцентов в процессе хранения г. Краснодар, ВНИИМК, 2018 г.

Срок хранения, через месяц	Штамм	Титр, КОЕ/г
		При температуре, оС
		+24…+26 оС	+30 оС	- 18 оС
3	РК-1-3	1,5 × 1010	4,3 × 109	4,5 × 1010
	Б-12	6,5 × 1012	6,8 × 1012	7,5 × 1012
6	РК-1-3	8,5 × 109	8,6 × 105	4,8 × 1010
	Б-12	4,3 × 1012	3,6 × 1012	6,5 × 1012
9	РК-1-3	6,8 × 109	4,3 × 104	5,5 × 1010
	Б-12	2,8 × 1012	1,3 × 1012	7,0 × 1012
12	РК-1-3	2,5 × 109	2,1 × 103	3,8 × 1010
	Б-12	1,5 × 1012	1,1 × 1012	4,8 × 1012

Примечание: исходный титр СП смесевого микробиопрепарата: РК-1-3 – 3,5 × 10¹⁰ КОЕ/г; Б-12 – 7,1 × 10¹² КОЕ/г

При хранении лабораторных образцов смесевого микробиопрепарата при переменной температуре (+24…+26 °С), также как и для СП на основе отдельных штаммов-продуцентов, титр бактериального штамма-продуцента сохранялся через двенадцать месяцев на исходном уровне (1,5 × 1012 КОЕ/г), а у грибного – снизился на порядок (2,5 × 109 КОЕ/г).

При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр лабораторных образцов СП смесевого микробиопрепарата через двенадцать месяцев для бактериального штамма сохранился на первоначальном уровне, а для грибного – снизился до 103 КОЕ/г, поэтому хранить смесевой препарат в этих условиях нецелесообразно.

При хранении лабораторных образцов СП смесевого микробиопрепарата при постоянной низкой температуре (-18 °С) через двенадцать месяцев титр сохранялся на первоначальном уровне как у грибного, так и у бактериального штаммов-продуцентов (3.8 × 1010 КОЕ/г и 4,8 × 1012 КОЕ/г соответственно).

Выводы. 1. Определена совместимость штаммов-продуцентов смесевого микробиопрепарата на агаризированных питательных средах. На нейтральной питательной среде (КСА) гриб и бактерия росли, не мешая друг другу, тогда как на специализированной для бактерии среде (Тайлона-3) бактерия занимала большую часть поверхности питательной среды и подавляла рост гриба-продуцента.

• 2.    Оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма РК-1-3 Penicillium vermiculatum на жидкой среде Рудакова составил 15 суток, а для бактериального штамма Б-12 Bacillus licheniformis -3 на жидкой среде Тайлона-3 – 10 суток.

• 3.    Установлена нецелесообразность совместного поверхностного культивирования исследованных грибного и бактериального штаммов-продуцентов микробиопрепарата, так как на обеих

• 4.    При переменной температуре (+24…+26 °С) через двенадцать месяцев хранения лабораторных образцов СП сме-севого микробиопрепарата также, как и на основе отдельных штаммов-продуцентов, титр бактериального штамма сохранялся на исходном уровне (1,5 × 10¹² КОЕ/г), а у грибного – снизился на порядок, но оставался высоким (2,5 × 10⁹ КОЕ/г).

• 5.    При постоянно высокой температуре (+30 °С) хранение смесевого препарата не целесообразно, так как титр грибного штамма-продуцента резко снижался – до 10³ КОЕ/г.

• 6.    При постоянной низкой температуре (-18 °С) через двенадцать месяцев хранения лабораторных образцов СП смесевого микробиопрепарата титр сохранялся на первоначальном уровне как у грибного, так и у бактериального штаммов-продуцентов.

жидких питательных средах бактерия занимала всю поверхность питательной среды и подавляла рост колонии гриба, даже на специализированной для гриба среде Рудакова.