Энергетический обмен в мышечной ткани при статических и динамических нагрузках (экспериментальное исследование)

Введение. Успех в современной системе спортивной тренировки во многом связан с учетом физиологических перестроек в скелетных мышцах. Имеющиеся данные об особенностях метаболизма и композиции мышечных волокон у спортсменов различных специализаций свидетельствуют о том, что физиологические особенности мышечной ткани в значительной мере обусловливает достижения спортсменов в том или ином виде спорта [3]. Эти свойства мышц частично генетически детерминированы, однако под воздействием тренировок определенной направленности происходит существенное изменение экспрессии генов и, соответственно, морфологических, физиологических и биохимических свойств мышечной ткани [1, 18, 25].

В последние годы представления о метаболических процессах в скелетных мышцах существенно расширились. Внимание исследователей привлекает способность скелетных мышц продуцировать биологически активные вещества [13, 20]. В настоящее время сформировалось представление об эндокринной функции скелетных мышц. Вещества, вырабатываемые мышечными клетками при сокращении, называются «миокинами» [14, 24].

Физические нагрузки способствуют увеличению содержания Na+ в скелетных мышцах в 3–4 раза и снижению К+ до 50 %. Это связано с активацией ионных каналов, а также с частичным ингибированием Na+/K+-АТФ-азы [17, 19]. Повышение внутриклеточного отношения Na+/K+ является достаточным условием для изменения транскрипции десятков универсальных и сотен тканеспецифичных генов и может служить регулятором процессов энергетического обмена [23].

В литературе представлены многочисленные работы, содержащие рекомендации по построению тренировочного процесса в различных видах спорта, основанные на отдельных биохимических характеристиках, однако они во многом противоречат друг другу [1, 7]. Одна из причин этого – при исследованиях на спортсменах объектом анализа, как правило, является кровь, что позволяет лишь косвенно судить о процессах, протекающих в мышечной ткани.

Целью данного исследования было оценить влияние физической активности на энергетический обмен в скелетных мышцах нетренированных и предварительно тренированных экспериментальных животных (мышей).

Материалы и методы исследования. В качестве экспериментальных животных использовали половозрелых (8–12 недель) мышей-самцов линии С57Вl/6 массой 25–30 г (виварий НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, Томск, Россия). Для исследования были сформированы группы для острого (нетренированные мыши) и хронического (тренированные мыши) эксперимента.

В первой части исследования использовали динамическую нагрузку в виде принудительного плавания [2, 15] с утяжелением 5; 7,5 и 10 % от массы тела (n = 130). Во второй части исследования использовалась статическая нагрузка в виде виса на горизонтальной сетке [2] с аналогичными утяжелениями (n = 130). Утяжеление представляло собой груз в виде свинцовых шариков, который фиксировался на спине животного с помощью специально изготовленного рюкзака, в лямки которого продевались передние лапы и который крепился под брюшком. Наиболее оптимальной модификацией теста Портсольта для оценки физической выносливости является плавание животного с нагрузкой 10 % от веса тела. Использование нагрузки более 15 % приводит к быстрому утомлению, а плавание с нагрузкой менее 5 % способствует обучению животных.

В каждой части исследования в остром эксперименте мыши контрольной группы (n = 5) не подвергались физической нагрузке. Мыши опытной группы (n = 60) подвергались однократной (тестовой) физической нагрузке.

В хроническом эксперименте все мыши подвергались регулярной физической нагруз- ке (тренировке) ежедневно в течение 4 недель по 1 часу в день без утяжеления. После этого мышей разделяли на две группы: контрольную (n = 5) и опытную (n = 60). Исследование проводилось по той же схеме, что и в первом (остром) опыте. В этом случае тестовую нагрузку мыши проводили через сутки после завершения последней тренировочной нагрузки. Динамические упражнения выполнялись максимум 1 час. Статические упражнения прекращали, когда мышь падала с сетки 3 раза.

Забой животных (методом декапитации) проводили сразу после пробной нагрузки, а также через 1, 5 и 24 часа. Материалом для исследования служили мышцы, извлеченные сразу после декапитации. В зависимости от физической нагрузки извлекали 2 типа мышц: камбаловидную мышцу (musculus soleus) у мышей, которые плавали, и двуглавую мышцу (musculus biceps) у мышей, которые висели на сетке.

Содержание лактата в скелетных мышцах определяли колориметрическим методом. Использовали набор для анализа лактата (колориметрический) производства Cell Biolabs (США).

Определение концентрации гликогена в мышечной ткани проводили с использованием набора для анализа гликогена (кат. № ab65620, ABCAM, Великобритания) с использованием фотометра для микропланшетов Anthos 2010 с программным обеспечением (Biochrom Ltd, Великобритания). Определение концентрации общего белка в образце проводили по методу Брэдфорда. Концентрация гликогена представлена в пересчете на общий белок.

Определение цитратсинтазы, общего ОКСФОС и концентрации изоформы Na+/K+-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани выполняли методом вестерн-блоттинга. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях с 5%-ным концентрирующим и 7%-ным разделяющим гелями с использованием электрофоретической системы (электрофоретическая ячейка (Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad, США), блок питания (PowerPacBasic, США)). Данные вестерн-блоттинга представлены в относительных единицах по сравнению с контролем. Контрольные значения приняты за 100 %.

Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. После проверки нормального распределения данных с помощью критерия Колмогорова – Смирнова характеристики

Рис. 1. Концентрация лактата в гомогенате скелетных мышц:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки; В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки; C – группа нетренированных животных после однократной статической нагрузки; D – группа тренированных животных после однократной статической нагрузки. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05; # – достоверность различий между тренированными и нетренированными животными одинаковой нагрузки, р < 0,05

Fig. 1. Concentration of lactate in the skeletal muscle homogenate:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise; C – group of untrained animals after a single static exercise; D – group of trained animals after a single static exercise. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise), р < 0.05; # – significance of differences between trained and untrained animals for the same exercise, p < 0.05

анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа Краскела – Уоллиса. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета приложений GraphPad Prism Version 9.3.1.

Исследования были рассмотрены и одобрены комитетом по биоэтике Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета; протокол № 32 от 02.12.2019.

Результаты исследования. Концентрация лактата в мышечной ткани. У нетренированных животных концентрация лактата в мышцах увеличивается относительно ис- ходного уровня сразу после однократной динамической нагрузки (рис. 1А). Существует прямая связь между степенью применяемого утяжеления и увеличением концентрации лактата. Через час после физической нагрузки концентрация лактата возвращается к исходному уровню и уже не меняется в течение суток.

После 5 недель тренировок в виде ежедневного принудительного плавания мы также наблюдали увеличение концентрации лактата в мышцах в ответ на однократную нагрузку, но прирост был ниже, чем у нетренированных животных (рис. 1В).

Рис. 2. Концентрация гликогена в гомогенате скелетных мышц:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки. В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки. C – группа нетренированных животных после однократной статической нагрузки. D – группа тренированных животных после однократной статической нагрузки. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05. # – достоверность различий между тренированными и нетренированными животными одинаковой нагрузки, р < 0,05

Fig. 2. Concentration of glycogen in the skeletal muscle homogenate:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise; C – group of untrained animals after a single static exercise; D – group of trained animals after a single static exercise. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise), р < 0.05; # - significance of differences between trained and untrained animals for the same exercise, p < 0.05

Повышение концентрации лактата было особенно низким у животных, плававших без отягощений. По-видимому, регулярные динамические нагрузки оказывают тренировочный эффект за счет повышения аэробной производительности [4].

У нетренированных животных концентрация лактата в мышцах увеличивалась при однократной статической нагрузке по сравнению с исходным уровнем сразу после тренировки (рис. 1С). В этом случае также наблюдается четкая взаимосвязь между применяемой степенью утяжеления и увеличением концентрации лактата. Через час после стати- ческой нагрузки концентрация лактата возвращается к исходному уровню и уже не меняется в течение суток. У животных, подвергавшихся ежедневным статическим нагрузкам в виде подвешивания на сетке в течение месяца (рис. 1D), прирост концентрации лактата не отличался от значений, полученных нами в группе нетренированных животных.

Содержание гликогена в скелетной мышечной ткани. У нетренированных животных концентрация гликогена в мышцах при однократной динамической нагрузке снижается относительно исходного уровня сразу после выполнения физической работы (рис. 2А), независимо от утяжеления. Через час после нагрузки концентрация гликогена увеличивается у животных, плавающих с утяжелением 5 и 7,5 % от массы тела. Через пять часов концентрация гликогена во всех группах возвращается к исходному уровню.

После 5 недель тренировок в виде ежедневного принудительного плавания мы наблюдали увеличение концентрации мышечного гликогена в ответ на однократное упражнение, особенно у животных, плавающих с утяжелением 5 и 7,5 % от массы тела (рис. 2В). Этот эффект сохранялся в течение 5 часов (за исключением животных, плавающих без утяжеления). Отсутствие падения мышечного гликогена и повышение уровня лактата может быть связано с потреблением глюкозы из крови или источников гликогена (например, печени).

У нетренированных животных концентрация гликогена в мышцах при однократной статической нагрузке снижается относительно исходного уровня сразу после выполнения физической работы (рис. 2С) пропорционально степени утяжеления. Через час после нагрузки увеличивается концентрация гликогена у животных, выполнявших вис с отягощением 7,5 и 10 % от массы тела. Через пять часов концентрация гликогена возвращается к исходному уровню, и только у животных, выполнявших вис без утяжеления, остается сниженной.

Через месяц занятий в виде ежедневного висения на сетке мы наблюдали снижение концентрации мышечного гликогена в ответ на одно упражнение, за исключением случаев выполнения упражнений без утяжеления (рис. 2D).

Общее содержание белков OXPHOS в ткани скелетных мышц. Для оценки энергетического обмена использовали коктейль с антителами Total OXPHOS Rodent WB, определили пять маркеров: NDUFB8, SDHB, UQCRC2, MTCO1, ATP5F1A.

У нетренированных животных повышенное содержание всех перечисленных маркеров в мышцах отмечалось через час после однократной динамической нагрузки, если она выполнялась с утяжелением 10 % (рис. 3А). При выполнении нагрузки с утяжелением 5 % содержание указанных белков увеличилось на 24-й час. После месяца ежедневных тренировок по принудительному плаванию мы наблюдали увеличение исходного количества SDHB (рис. 3H) и NDUFB8 (рис. 3В). После однократной динамической нагрузки отмечено увеличение содержания всех перечисленных маркеров, если нагрузку выполняли с утяжелением 5 %.

После однократной статической нагрузки у нетренированных животных повышенная концентрация всех перечисленных маркеров в мышцах отмечалась уже через час и сохранялась в течение 24 часов. Выраженной зависимости от степени утяжеления мы не наблюдали (рис. 4А). Через месяц тренировок в виде ежедневного принудительного висения на сетке мы наблюдали увеличение исходной концентрации всех маркеров (рис. 4В). После однократной статической нагрузки концентрация всех перечисленных маркеров не изменилась.

Содержание цитратсинтазы в мышечной ткани. У нетренированных животных повышенное содержание цитратсинтазы в мышцах отмечалось через час после однократной динамической нагрузки, если она выполнялась с утяжелением 10 % (рис. 5А). При выполнении нагрузки с утяжелением 5%-ная концентрация цитратсинтазы возрастала на 24-й час. Через месяц тренировок в виде ежедневного принудительного плавания мы наблюдали незначительное повышение концентрации цитратсинтазы в мышцах в ответ на однократное физическое упражнение через час только у животных, выполнявших нагрузку с 5%-ным утяжелением (рис. 5В).

У нетренированных животных через час после однократной статической нагрузки концентрация цитратсинтазы в мышцах удваивалась независимо от степени утяжеления (рис. 5С). Через 24 часа этот показатель несколько снизился, но остался выше исходных значений. Через месяц тренировок в виде ежедневных принудительных висов на сетке мы наблюдали двукратное увеличение концентрации цитратсинтазы в мышцах в состоянии покоя. В ответ на одиночное упражнение через час наблюдалось некоторое снижение только у животных, выполнявших нагрузку с 10%-ным утяжелением (рис. 5D).

Содержание изоформы Na⁺/K⁺-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани. У нетренированных животных повышение содержания изоформы Na⁺/K⁺-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани выявлялось через час после однократной динамической нагрузки независимо от утяжеления и сохранялось на повышенном уровне в течение 24 часов (рис. 6А).

Рис. 3. Концентрация в гомогенате скелетных мышц после динамической нагрузки, % относительно контрольной группы:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки; В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки. 1 – ATP5A; 2 – UQCRC2; 3 – MTCO1; 4 – SD HB; 5 – NDUFB8. Темные столбики – утяжеление 5 %, светлые столбики – 10 %. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05

Fig. 3. Concentration in the skeletal muscle homogenate after dynamic exercise, % relative to the control group:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise. 1 – ATP5A; 2 – UQCRC2; 3 – MTCO1; 4 – SD HB; 5 – NDUFB8. Dark bars – weighting 5%, light bars – 10%. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise), р < 0.05

Рис. 4. Концентрация в гомогенате скелетных мышц после статической нагрузки, % относительно контрольной группы:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки. В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки. 1 – ATP5A; 2 – UQCRC2; 3 – MTCO1; 4 – SD HB; 5 – NDUFB8. Темные столбики – утяжеление 5 %, светлые столбики – 10 %. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05

Fig. 4. Concentration in the skeletal muscle homogenate after static exercise, % relative to the control group:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise. 1 – ATP5A; 2 – UQCRC2; 3 – MTCO1; 4 – SD HB; 5 – NDUFB8. Dark bars – weighting 5%, light bars – 10%. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise), р < 0.05

Рис. 5. Концентрация цитратсинтазы в гомогенате скелетных мышц после физической нагрузки, % относительно контрольной группы:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки; В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки; C – группа нетренированных животных после однократной статической нагрузки; D – группа тренированных животных после однократной статической нагрузки. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05; # – достоверность различий между тренированными и нетренированными животными, р < 0,05

Fig. 5. Concentration of citrasynthase in the skeletal muscle homogenate after exercise, % relative to the control group:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise; C – group of untrained animals after a single static exercise; D – group of trained animals after a single static exercise. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise), р < 0.05; # – significance of differences between trained and untrained animals, р < 0.05

Через месяц тренировок в виде ежедневного принудительного плавания мы наблюдали двукратное увеличение концентрации изоформы Na+/K+-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани перед нагрузкой. В ответ на однократное упражнение через час концентрация фермента не изменилась, незначительное повышение отмечено через 24 часа только при утяжелении 5 % (рис. 6В).

У нетренированных животных повышение концентрации изоформы Na+/K+-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани выявлялось через час после однократной статической нагрузки и сохранялось на повышенном уровне в течение 24 часов (рис. 6С). Увеличение было несколько более выраженным с 5%-ным утяжелением, чем с 10%-ным.

После месяца тренировок в виде ежедневных принудительных висов на сетке мы наблюдали более чем трехкратное увеличение концентрации изоформы Na+/K+-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани перед нагрузкой (рис. 6D). В ответ на однократное статическое упражнение через час концентрация

Рис. 6. Концентрация α2 Na+/K+-AТФ-азы в гомогенате скелетных мышц после динамической нагрузки:

А – группа нетренированных животных после однократной динамической нагрузки; В – группа тренированных животных после однократной динамической нагрузки; C – группа нетренированных животных после однократной статической нагрузки; D – группа тренированных животных после однократной статической нагрузки. * – достоверность различий соответствующего показателя с концентрацией до нагрузки, р < 0,05; # – достоверность различий между тренированными и нетренированными животными, р < 0,05

Fig. 6. Concentration of α2 Na+/K+-ATP-ase in the skeletal muscle homogenate after dynamic exercise:

A – group of untrained animals after a single dynamic exercise; B – group of trained animals after a single dynamic exercise; C – group of untrained animals after a single static exercise; D – group of trained animals after a single static exercise. * – significance of differences compared to baseline concentration (pre-exercise); р < 0.05; # – significance of differences between trained and untrained animals, р < 0.05

фермента снижалась, к 24 часам отмечалось дополнительное снижение. При утяжелении 5 % снижение было более выраженным.

Обсуждение. Концентрация лактата в мышцах - объективный показатель, позволяющий интегрально оценить реакцию организма на физическую нагрузку, степень напряжения адаптационных механизмов и активацию метаболических процессов [4]. Во всех группах наблюдалась сходная динамика изменения концентрации лактата в мышечной ткани. После физической нагрузки отмечено значительное увеличение лактата с последующим возвращением к базальному уровню в течение 24 часов.

Гликоген представляют собой энергетический субстрат, который может использоваться для ресинтеза энергии АТФ при мышечной работе. В настоящее время также признано, что гликоген является мощным регулятором сигнальных путей в мышечной клетке [6]. Концентрация гликогена увеличивалась позже - через час и более - и у предварительно тренированных животных дольше оставалась на повышенном уровне. Также предварительная тренировка, как динамическая, так и статическая, повышала показатели мышечного энергетического обмена (увеличение уровня гликогена). Однако у предтре-нированных животных реакция на однократ- ную нагрузку была менее выражена, чем у нетренированных.

В результате исследования изменения цитратсинтазы и ферментов системы OXPHOS на фоне однократной физической нагрузки было выявлено увеличение данных ферментов после однократной физической нагрузки. Содержание этих ферментов характеризует общий энергетический потенциал клетки [21, 25]. В то же время регулярные тренировочные нагрузки статического и динамического характера по-разному влияли на содержание этих ферментов. Прирост содержания цитратсинтазы и ферментов системы OXPHOS был существенно более выражен под влиянием упражнений статического характера, чем динамического. В то же время, если у тренированных животных в ответ на однократную динамическую нагрузку отмечался дополнительный прирост данного фермента, то на статическую реакция отсутствовала, а со стороны цитратсинтазы даже наблюдалось снижение.

Как динамические, так и статические нагрузки влияют на содержание одновалентных катионов в клетках скелетных мышц, вызывая увеличение внутриклеточного соотношения Na+/K+. Как было показано в предыдущей нашей работе [9], отчетливо видна связь между степенью применяемого утяжеления и изменением диссипации одновалентных катионов. Через месяц тренировок в мышцах отмечается повышенное содержание Na+ и K+, но соотношение Na+/K+ остается неизменным. После физических нагрузок у тренированных животных отмечена корреляция между изменением концентрации изоформы Na+/K+-АТФ-азы альфа 2 в мышечной ткани и содержанием в ткани одновалентных катионов.

Возбуждение миоцитов сопровождается изменением трансмембранного градиента одновалентных катионов за счет притока Na⁺ и оттока K⁺ через потенциалзависимые и Са²⁺-чувствительные ионные каналы. Ранее, чтобы оценить относительный вклад Ca²⁺ i -опосре-дованного и Ca²⁺ i -независимого сигнальных путей, мы сравнили транскриптомные изменения с увеличением отношения Na⁺/K⁺ в клетках, истощенных по Ca²⁺, и обнаружили увеличение числа специфические Na⁺/K⁺-чувствительные гены [10, 11].

Однако молекулярная природа сенсоров, посредством которых осуществляется внут- риклеточная Na+ и K+ регуляция процессов транскрипции и трансляции, до сих пор остается предметом дискуссий [5, 22]. В этом аспекте интересен тот факт, что увеличение отношения Na+/K+ в цитоплазме клеток скелетных мышц при сокращении сопровождается повышением активности α2Na+/K+-АТФ-азы, которая способен частично нейтрализовать этот эффект благодаря высокому сродству этой изоформы фермента к внутриклеточному Na+ [12, 16].

Заключение. Подводя итог изложенному, можно отметить, что динамические и статические нагрузки по-разному влияют на показатели, характеризующие энергетический обмен в мышцах нетренированных и предварительно тренированных экспериментальных животных. Если эффекты однократных нагрузок статического и динамического характера различались не столь существенно, то влияние ежедневных тренирующих воздействий различалось значительно. Тренировки статического характера приводили к существенно более выраженным перестройкам в энергетическом метаболизме мышечных клеток. На показатели энергетического метаболизма у предварительно тренированных животных влияние однократной статической нагрузки было менее выражено, чем динамической.

Традиционно полагают, что клеточный состав скелетных мышц и фенотипические характеристики мышечных волокон, изменяясь в результате регулярных тренировок, могут модифицировать процессы энергетического метаболизма. Однако влияние физической нагрузки на диссипацию трансмембранных градиентов одновалентных катионов и обнаруженная в данной работе взаимосвязь соотношения одновалентных катионов и содержания α2Na+/K+-АТФ-азы позволяет предположить, что определенную роль в этом могут играть Na+/K+-зависимые механизмы запуска транскрипции генов.

Модификация этих механизмов под влиянием физических нагрузок различного характера и интенсивности представляет значительный интерес, так как является перспективным способом воздействия на метаболические процессы как на клеточном, так и на системном уровнях, что очень важно для улучшения спортивной работоспособности и для коррекции метаболических нарушений при ряде социально-значимых заболеваний.