Энкефалиназная активность, как одна из возможных причин акупунктурной резистентности

Боль, по-прежнему, остается одной из основных причин обращения людей за медицинской помощью. В многовековой борьбе с нею достигнуты значительные успехи, и современная медицина обладает широким спектром возможностей для коррекции болевых синдромов с помощью разнообразных способов их утоления. Все они основаны на знаниях, полученных к концу 20 столетия в научных алгологических исследованиях, в которых был сделан значительный, фундаментальный вклад в изучение механизмов боли. В результате этого были определены основные восходящие пути проведения болевой информации и очерчены главные мозговые структуры ноцицептивной системы, осуществляющие передачу, обработку и восприятие действия повреждающих факторов [1, 15]. Наряду с этим, были описаны нейрохимические механизмы ноцицепции с детальным определением нейромедиаторов и нейромодуляторов болевых реакций, а также их многочисленных рецепторов [3, 4, 12, 14, 16, 22]. Значительный вклад в понимание болевых аспектов жизнедеятельности внесло открытие в 7080 годах прошлого столетия разнообразных эндогенных антиноцицептивных систем, давшее в очередной раз толчок к появлению новых, к сожалению, до сих пор несбыточных надежд на эффективное лечение болей различной этиологии [10, 16, 17]. Но эти знания позволили во многом объяснить и усилить анальгетические эффекты спинномозговой анестезии, наркотических и ненаркотических анальгетиков, противовоспалительных препаратов, местных и общих анестетиков, а также различных видов не медикаментозных методов рефлексотерапии, в том числе, таких как акупунктура [19, 20, 23].

Одним из направлений фундаментальных физиологических и биохимических проблем механизмов боли и обезболивания является изучение индивидуальных особенностей болевой чувствительности у человека и животных, лежащих в основе персонифицированного подхода в применении обезболивающих средств. При этом, в практической медицине хорошо известна вариабельность эффективности различных обезболивающих фармакологических препаратов, а также широко применяемого акупунктурного воздействия, при использовании которых наблюдались как четко выраженные обезболивающие эффекты, так и более слабые, или полное их отсутствие. Установлено также, что при акупунктурной стимуляции с различными частотными характеристиками у животных и человека имеет место активация эндогенных антиноцицептивных систем, в том числе опиоидэргической, с выделением эндогенных опиоидов, что в итоге приводит к ингибированию проведения ноцицептивного потока [11, 18, 21]. Свидетельством активации эндогенной опиоидной системы при акупунктуре также является уменьшение ее болеутоляющего действия при различных способах подведения налоксона к основным антиноци-цептивным структурам головного мозга [2, 8].

В тоже время, и у животных и у людей существуют акупунктуро-резистентные индивидуумы, у которых отмечено значительно меньшее содержание эндогенных опиоидов [19]. Поэтому возможно, что именно генетические факторы, определяющие активность эндогенных болеутоляющих систем, определяют диапазон индивидуальной вариабиль-ности болеутоляющих эффектов акупунктуры. С одной стороны данная физиологическая особенность может поддерживаться на определенном уровне за счет синтеза эндогенных опиоидов, а с другой - за счет их инактивации, осуществляемой пептидгидролазами (энкефалиназами и эндорфина-зами) [9]. В связи с этим, целью настоящего исследования явилась оценка возможной роли энкефали-назы в развитии акупунктурной резистентности с учетом индивидуальных особенностей ноцицептивной чувствительности животных.

Методика исследования.

Эксперименты проведены на 21 бодрствующем кролике-самце породы Шиншилла массой 3-3,5 кг. Кроликов содержали в виварии при температуре 20-22оС на стандартном пищевом рационе в искусственных условиях освещения (9:00-21:00 - свет, 21:00-9:00 - темнота). При проведении опытов руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии ГУ НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН (протокол №1 от 3.09.2005), требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Показателем изменений ноцицептивной чувствительности у кроликов служили изменения амплитуды негативно-позитивного компонента (НПК) вызванных потенциалов (ВП) соматосенсорной области коры в ответ на электродентальное раздражение (ЭДР) - электростимуляцию пульпы верхних резцов. Животных мягко фиксировали за конечности в специальном станке, что позволяло им производить незначительные движения лапами и свободные головой. За два-три дня до проведения экспериментов животных скальпировали под местной новокаиновой анестезией с последующей дезинфицирующей обработкой раневой поверхности мягких тканей головы. Одновременно с этим в верхней трети верхних резцов с двух противоположных сторон с помощью миниатюрной бормашины просверливали отверстия диаметром 1мм. В последующем в эти отверстия вставлялись игольчатые стальные электроды, служившие для ЭДР. Спустя 20-30 мин после установления раздражающих электродов не отмечались какие-либо выраженные проявления беспокойства у подопытных животных.

В качестве ноцицептивного воздействия использовали ЭДР - одиночные прямоугольные импульсы тока (0,1 мсек, 1-10 мА) с частотой 0,5 герц, подаваемые от электростимулятора "Nihon Kohden" (Япония).

Регистрация ВП осуществлялась с поверхности черепа животных в области сенсомоторной коры. Для этого игольчатые регистрирующие электроды диаметром 0,8 мм фиксировались в костях черепа самоотвердевающей пластмассой "Норакрил". При монополярном отведении активный электрод располагался в проекционной области сенсомоторной коры на 1-5 мм каудальнее и на 1-6 мм латеральнее "брегмы", а индифферентный - в области переднего шва. Выбор точной локализации активного электрода осуществлялся непосредственно в эксперименте по той точке, в которой регистрировалось наиболее четкое проявление вторичных компонентов ВП на ноцицептивное ЭДР.

Регистрация ВП проводилась с помощью усиления биоэлектрической активности через отечествен- ный усилитель УБФ-4-03 (полоса пропускания от 2 до 100 Гц) и электромиографа "DISA"14A11 (Дания). Усреднение и суммирование ВП осуществлялись на венгерском амплитудно-фазовом анализаторе NTA-1024 фирмы "Орион" по 10 предъявлениям. Запись ВП проводили на X-Y рекордере той же фирмы.

Эксперименты проводили по следующей схеме: животных размещали в станке, и последующие манипуляции осуществляли, как минимум, через 30-ти минутный период адаптации. Первоначально определяли оптимальную локализацию активного регистрирующего электрода в области соматосенсорной коры. Затем регистрировали изменения ВП в ответ на ноцицептивное ЭДР с прогрессивно увеличивающейся или снижающейся силой тока. В дальнейшем использовали значение силы тока, превышающее в 1,5 раза значение пороговой силы тока, при которой наблюдалась поведенческая реакция облизывания раздражающих электродов.

При постоянной силе тока раздражения производили 5-ти кратную регистрацию ВП у каждого кролика через 10-15 минутные интервалы. Значения амплитуды вторичного НПК ВП с латентным периодом (ЛП) 20-40 мсек считали фоновыми значениями, усредненная величина которых принималась за 100%. В дальнейшем по отношению к этой фоновой величине амплитуды ВП высчитывали изменения амплитуды НПК в процентах. После регистрации фоновых значений амплитуды ВП осуществляли либо аурикулярную электропунктуру, либо введение фармакологических веществ.

Аурикулярную электропунктурную стимуляцию (АЭ) осуществляли с помощью аппарата для дентальной аналгезии "Аналгедента" предприятия "РИСС". Прямоугольные импульсы тока длительностью 100 мкс, силой до 25 мкА с частотой 15 Гц в течение 25 минут подавали биполярно на активные чашечные электроды, прикрепляемые клипсами к козелку уха кролика. Индифферентный игольчатый электрод при этом располагался в области верхней десны.

Интенсивность стимуляции подбирали в каждом случае индивидуально, до появления небольших фибрилляций ушей. Сразу после включения электрической стимуляции у животных возникала своеобразная реакция, проявляющаяся поворотами головы, обнюхиванием и замиранием. Через 3-5 мин после начала стимуляции животные, как правило, принимали удобную позу с полузакрытыми глазами и не меняли своего положения в течение всего последующего периода электропунктуры.

Регистрацию ВП соматосенсорной коры у кроликов в ответ на ЭДР производили до и после применения АЭ.

В опытах в качестве блокатора энкефалиназной активности использовали д-фенилаланин (д-ФА) ("Serva") в дозе 600 мг/кг, внутри-брюшинно в объеме 5 мл (18,19) и физиологический раствор (в ам- пулах) для контрольных введений аналогичным образом и в соответствующем объеме [5, 6].

Статистическую достоверность изменений значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры кроликов в ответ на ЭДР определяли по U критерию Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение.

У всех кроликов элктрораздражение пульпы зуба одиночными импульсами тока вызывало появление ВП в соматосенсорной коре, который был представлен первичным ответом с ЛП 11,0+0,8 мс, последующим негативным отклонением с ЛП в 21,1+2,6 мс и последующим позитивным отклонением с ЛП 35,7+6,1 мс. Пиковые значения амплитуды негативного и вторичного позитивного компонента ВП четко коррелировали с силой раздражающего тока: при градуальном увеличении силы тока с 1 до 10 мА наблюдалось также градуальное увеличение значений амплитуды данного негативно-позитивного компонента ВП с 20,1+3,1 мкв до 117,8+4,4 мкв. Соответственно, при уменьшении силы раздражающего тока наблюдалось градуальное снижение амплитуды данного компонента ВП.

В проведенных опытах у 10-и кроликов применение АЭ вызывало анальгетический эффект достоверного (р<0,01) снижения амплитуды НПК ВП в ответ на одну и ту же по силе тока электростимуляцию пульпы зуба в среднем до 41+17% от исходных ее значений сразу после выключения АЭ, до 48+9% через 10 мин, до 54+12% и 60+5% через 20 и 30 мин, до 67+5% через 40 мин, до 70+9% через 50 мин после выключения АЭ. Только через 60-70мин после выключения АЭ величины амплитуды НПК ВП в ответ на то же электродентальное раздражение восстанавливались до значений, не имеющих достоверных различий с исходными величинами НПК ВП. В течение последующего часа наблюдений, колебания значений амплитуды НПК ВП в ответ на ЭДР не имели достоверных различий с исходными величинами и колебались в пределах +10%.

Таким образом, применение АЭ у данных животных вызывало анальгетический эффект, наблюдаемый в течение 50-60 мин после выключения АЭ (акупунктуро-чувствительные животные).

У 11 кроликов применение АЭ не вызывало достоверных изменений амплитуды НПК ВП в ответ на одно и то же по силе тока ЭДР, что было прослежено в течение 60-70 мин после выключения АЭ. Величины амплитуды НПК ВП колебались в пределах ±12%, что свидетельствовало об отсутствии у них анальгетического эффекта АЭ (акупунктуро-резистентные животные).

Известно, что при АЭ имеет место увеличение выделения эндогенных опиоидов [19, 23], что и приводит к блокаде ноцицептивной импульсации, и аналгетический эффект АЭ может блокироваться налоксоном [2, 8]. В то же время, у акупунктурорезистентных животных при АЭ имеет место низкое исходное содержание эндогенных опиоидов по сравнению с акупунктуро-чувствительными особями [19] что, вероятно, и приводит к отсутствию анальгетического эффекта АЭ.

Существуют экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что акупунктуро - резистентные животные являются в то же время морфин - резистентными особями, что подтверждает данные других авторов с применением иных ноцицептивных раздражителей, в частности электрокожного, и при использовании электроакупунктурной стимуляции корпоральных точек [7,19]. Поскольку анальгетический эффект морфина, также как и анальгетический эффект АЭ связывается с блокадой ноцицептивной импульсации эндогенными опиоидами, увеличение выделения которых имеет место при введении морфина [2, 13], можно предположить, что именно недостаток эндогенных опиоидов у акупунктуро - резистентных животных определяет у них отсутствие анальгетического эффекта как акупунктуры, так и морфина.

В наших опытах изолированное введение д-фенилаланина акупунктуро-чувствительным кроликам (n=5) не приводило к достоверным изменениям значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР с постоянной силой тока в течение 60 мин регистрации после инъекции ингибитора эн-кефалиназы: значения амплитуды данного показателя ноцицепции колебались в пределах +11% от исходных величин.

Изолированное введение д-фенилаланина акупунктуро-резистентным кроликам (n=6) вызывало анальгетический эффект достоверного (р<0.01) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР с постоянной силой тока до 82+5% от исходных величин через 10-15 мин, до 75+8% - через 20-30 мин и до 79+9% через 40-50 мин после введения данного вещества. Восстановление амплитуды НПК ВП до значений, не имеющих достоверных различий с исходными величинами, наблюдалось к 50-60 мин после введения д-фенилаланина.

Введение аналогичного объема физиологического раствора не приводило к достоверным изменениям используемого показателя ноцицепции как у акупунктуро-чувствительных (n=5), так и у акупунктуро-резистентных (n=5) животных в течение часа после введения препарата.

Таким образом, введение ингибитора энкефали-назы не отражалось на уровне болевой чувствительности акупунктуро-чувствительных кроликов и вызывало анальгетический эффект у акупунктуро - резистентных особей. Можно предположить, что обнаруженные различия эффектов действия этого ингибитора могут быть связаны с различиями уровня активности энкефалиназы у данных животных в структурах опиоидной эндогенной антиноцицептивной системы и, изначально, с более высоким уровнем выделения эндогенных опиоидов у акупунктурорезистентных животных. В свою очередь, вероятно, что этот показатель нивелируется у них исходно более высоким уровнем активности эндопептидаз.

Чтобы проверить это, мы изучили эффекты комбинированного действия д-фенилаланина и АЭ у акупунктуро-резистентных кроликов (n=6). Изначально у данных животных применение АЭ не вызывало анальгетического эффекта снижения амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР в течение 50 мин регистрации после выключения АЭ. Вслед за этим, данным кроликам вводили д-фенилаланин, что приводило у них к анальгетическому эффекту достоверного (р<0,01) снижения значений амплитуды НПК ВП, в среднем до 71 + 5% от исходных величин через 15 мин после введения препарата, до 62 + 5% - через 30 мин и до 78 + 5% - через 40 мин, с восстановлением до 89 + 9% от исходных величин через 50 мин после инъекции д - фенилаланина. Повторное применение АЭ у данных животных через 60 мин после введения д-фенилаланина, т.е. после исчезновения его анальгетического эффекта, вновь приводило к достоверному (р<0,01) снижению значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР до 65 + 5% от исходных значений в течение 40-45 мин и до 82 + 6% через 50-55 мин после выключения АЭ с восстановлением амплитуды ВП, не имеющих достоверных различий с исходными значениями (94 + 8%) через 60 мин после АЭ.

Таким образом, введение ингибитора энкефа-линазы, предваряющее акупунктурное воздействие, превращало акупунктуро-резистентных животных в акупунктуро-чувствительных. Вероятно, что проявление анальгезии в ответ на АЭ у акупунктурорезистентных кроликов после введения ингибитора энкефалиназы связано с увеличением содержания эндогенных опиоидов, что, в свою очередь, указывает на существенную роль высокого уровня активности данного фермента в структурах эндогенной опиоидной антиноцицептивной системы в инициации акупунктурной толерантности.

Данные результаты опытов также указывают на то, что акупунктурная резистентность может быть опосредована, как высоким уровнем активности эндопептидаз, так и высокой скоростью инактивации эндогенных опиоидов, через выделение которых реализуется анальгетический эффект акупунктуры, и содержание которых, как известно, значительно ниже у акупунктуро-резистентных особей [19]. Установлено, что акупунктурная анальгезия сопровождается усилением нейронной активности в основных структурах эндогенной антиноцицепти-ной системы – гипоталамусе и центральном сером веществе [17, 19]. Вероятно, что высокий уровень активности эндопептидаз, и в частности энкефали-назы, при акупунктурной резистентности имеет место в данных структурах.

Отсюда, можно предполагать, что одной из причин акупунктурной резистентности, определяющей низкое содержание эндогенных опиоидов в организме, является высокий уровень активности эндопептидаз, приводящий к ускоренной инактивации эндогенных морфиноподобных веществ. Вероятно, что именно вследствие этого, даже увеличение выделения эндогенных опиоидов под воздействием акупунктурной стимуляции не является достаточным, чтобы привести к полноценной блокаде проведения ноцицептивной импульсации, т.е. к анальгетическому эффекту.