Эритропоэтин улучшает эффекты мезенхимальных стволовых клеток в экспериментальной модели сепсиса

Сепсис является лидирующей причиной летальности, не связанной с сердечной патологией, в отделениях реанимации и интенсивной терапии во всем мире [1]. Несмотря на то, что благодаря внедрению современных клинических рекомендаций в развитых странах произошло снижение смертности при сепсисе с 37% до 30,8%, сами эксперты признают, что при существующем уровне развития медицины «потолок» выживаемости практически достигнут и дальнейшие ожидания связаны с появлением новых медицинских препаратов и технологий лечения тяжелого сепсиса и септического шока [2]. Одним из таких перспективных направлений можно считать трансплантацию мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток (МСК). Стоит заметить, что приоритет в открытии МСК принадлежит советскому ученому А.Я. Фриденштейну, чья статья "Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues" [3], датированная 1968 г., до настоящего времени является одной из наиболее цитируемых. Фри-денштейн первым в мире установил, что в костном мозге наряду с гемопоэтическими клетками существует популяция стволовых клеток, способных дифференцироваться в клетки мезенхимального ростка – фибробласты, остеоциты, хондроциты, адипоциты, что спустя несколько лет было подтверждено мно- гими исследованиями, выполненными на Западе. Особенностью МСК является не только потенциальная возможность их трансформации в гетерогенные клетки разных органов, получившая название пластичности, но и способность самостоятельно или опосредованно индуцировать продукцию ряда активных медиаторов разнообразных процессов – воспаления, фиброза, регенерации – цитокинов, факторов роста и их ингибиторов, ферментов и др. (паракринная активность) [4]. Процессы ускоренного апоптоза, эндотелиальная травма, нарушения микроциркуляции, угнетение иммуногенеза, повреждение миокарда – те патогенетические механизмы сепсиса, которые теоретически могут быть компенсированы паракринными и пластическими эффектами СК.

В 2007 г. J Xu et al. сообщили, что МСК, будучи введенными мышам вместе с бактериальным липополисахаридом, предотвращают не только острое повреждение легких, но и системный воспалительный ответ, достоверно снижая сывороточные уровни провоспали-тельных цитокинов IFN-γ, IL-1β , IL-6, MIP-1α и IL-8 [5]. Другое экспериментальное исследование, доказавшее эффективность МСК в модели сепсиса у мышей, вызванной перевязкой и пункцией толстой кишки, было выполнено Shirley H. J. Mei с коллегами в университете Оттавы [6]. В этой работе установлено не толь- ко снижение уровня маркеров системного воспаления под влиянием МСК, но и уменьшение бактериальной обсемененности селезенки и признаков полиорганной недостаточности. В еще одном исследовании на эндотоксемичес-кой модели сепсиса у крыс доказано снижение функциональной депрессии миокарда и подавление тканевой экспрессии интерлейкинов ИЛ-1р и ИЛ-6 у животных, получивших лечение МСК [7]. В дальнейшем те же авторы установили, что данные эффекты более выражены у МСК, донорами которых были самки [8].

Важным, недавно установленным свойством МСК, объясняющим их эффективность при инфекционных процессах, является самостоятельная продукция антимикробного пептида – кателицидина hCAP-18/LL-37, подавляющего рост Гр-отрицательных микроорганизмов. Поскольку при ингибировании данного протеина противоинфекционная активность МСК снижалась почти в 2 раза, авторы сделали вывод, что прямой антибактериальный эффект МСК при легочной инфекции сопоставим по значимости с традиционно упоминаемыми пластичностью и паракринной активностью [9]

.

Одним из ограничивающих факторов применения МСК при сепсисе и остром повреждении легких является высокая степень апоптоза трансплантируемых клеток. Она обусловлена с одной стороны апоптоз-стимулирующим эффектом провоспалительных цитокинов, прежде всего - фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), а с другой – окислительным стрессом, также ускоряющим гибель МСК и прогениторных клеток (клеток-предшественников) [10, 11]. Одним из направлений современной регенеративной медицины является поиск путей выживаемости трансплантированных СК и усиления их эффектов. Поскольку недавно стало известно, что МСК содержат на своей поверхности рецепторы к эритропоэтину (ЭПО) [12], мы предположили, что комбинированное введение МСК и ЭПО может предотвратить апоптоз последних и увеличить клиническую эффективность клеточной трансплантации. C этой целью было проведено экспериментальное исследование, результаты которого представлены в данной статье.

Материал и методы исследования: Мезенхимальные стволовые клетки:

Культура МСК (пассаж 5) была выращена из костного мозга крыс линии Вистар, самок, по модифицированной методике [13]. У крыс-доноров клетки костного мозга для посева в культуру получали из бедренной кости после введения им для эвтаназии раствора нембутала (70 мг/кг). Полученные в строго стерильных условиях примерно 107 костномозговых клеток помещали в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199 ("Sigma", USA), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендиро-вали в ростовой среде. В качестве ростовой использовалась среда RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональной телячей сыворотки. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля ("Sigma", USA) c площадью дна 25 см2, в которые вносили 5x106-107 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали их в обычный термостат 37оС. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина ("Sigma",USA) в новые флаконы вначале с той же площадью дна (25 см2 ), а впоследствии при нарастании клеточной массы – в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2. Такой метод позволял к концу 5-6 недели добиться получения популяции МСК в количестве (1-2)x108 клеток, достаточных для трансплантации в организм крыс-реципиентов. При изучении методом проточной цитофлюорометрии специфических маркеров полученных культур МСК было показано, что они относятся к популяции CD10low CD34– CD45– CD90+ CD105+ клеток, что характерно для клеток, происходящих из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма. Это заключение было подтверждено способностью полученной культуры клеток при изменении условий культивирования и использования соответствующих индукторов к дифференцировке в четырех исследованных в нашей работе направлениях – в остеоциты, хондроциты, адипоциты и кардиомиоциты (в последнем случае при применении деметили- рующего агента – 5-азацитидина).

Дизайн исследования: 50 крыс самок линии Wistar, в возрасте 3-х месяцев, весом 180-200 гр, были разделены на 5 групп по 10 животных в каждой (рис. 1).

1-я группа использовалась в качестве здорового контроля, а остальным интраперитонеально введен бактериальный липополисахарид,

Рис. 1. Дизайн исследования

выделенный из культуры Escherichia coli 0111: B4 (Sigma, USA) в дозе 20 мг/кг веса. Группа 2 оставлена в качестве контроля сепсиса. Спустя 2 часа после инъекции ЛПС животные получили следующее лечение: группа 3 – внутривенная инфузия 4x105 аллогенных МСК; группа 4 – внутривенное введение 8.5 мкг рекомбинантного ЭПО-Р; группа 5 - комбинацию МСК и ЭПО в эквивалентных дозах. Животных забивали через 72 часа путем внутрибрюшинного введения нембутала с забором крови на работающем сердце для гематологического и иммуно-ферментного анализа. Для дальнейшего морфологического исследования были использованы легкие, печень, почки, селезенка и тимус. В легкие для фиксации ткани интратрахеально через катетер вводили 10% формалин под давлением 20 см водн. ст. до их полного расправления. После этого перевязывали трахею и извлекали комплекс легкие-сердце из плевральной полости. Почки, печень, селезенку, тимус выделяли из органокомплекса и помещали вместе с легкими в 10% нейтральный формалин объемом, 5-кратно превышающим объем фиксируемых органов, на трое суток. Затем из каждого органа, кроме тимуса, вырезали кусочки толщиной 0,4 см. Вилочковую железу исследовали отдельно. Полученный материал обезвоживали в восходящих по концентрации спиртах, заливали в парафиновые блоки и приготавливали срезы толщиной 0,4-0,5 мкм по общепринятой методике. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван-Гизон. Проводился количественный, качественный и полуколичественный анализ результатов гистологического исследования полученных препаратов с использованием микроскопа Nicon eclipse 50i, камеры DS-Fi1 и компьютерной программы "NIS-Elements BR". Качественно оценивались степень проявления интерстициального и внутриальвеолярного отека легких, а также состояние кортико-медуллярного соотношения в ткани тимуса. Морфологические изменения печени и почек оценивали полуколичественным методом по шкале баллов: 0 – отсутствие изменений, 1 – незначительные изменения, 2 – умеренные, 3 – выраженные. При этом для анализа были выбраны следующие признаки: дистрофия гепатоцитов и эпителия проксимальных и дистальных почечных канальцев; степень сосудистого полнокровия ткани почек. Количественно оценивались объем белой пульпы селезенки, Т-лимфоцитов коркового вещества тимуса и тол- щина межальвеолярных перегородок.

Уровень лейкоцитов в крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе MEK-8222J/K (Япония). В сыворотке крови проводили измерение концентрации следующих цитокинов: ИЛ-10, ИЛ-6, TNF- a . Использованы ИФА наборы с антителами крыс Quantikine immunoassay и R&D systems. Иммуно-ферментный анализ выполнен на автоматическом плашечном ИФА-анализаторе ВЕР 2000 (Германия).

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета прикладных программ "Statistica for Windows StatSoft Inc.", Версия 6.0. Данные таблиц представлены как выборочное среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий оцениваемых показателей между исследуемыми группами вычисляли методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считали статистически достоверными при p<0,05.

Полученные результаты

Достоверной разницы в летальности между исследуемыми группами не установлено. Все животные умерли в течение первых суток эксперимента: в группах 2, 3, 5 – по 2 крысы; в группе 4 погибло 3 животных. Причинами смерти были острый респираторный дистресс-синдром (7 животных) и его комбинация с острой почечной недостаточностью (2 животных).

При оценке уровня лейкоцитов в крови достоверно большая, чем у других животных лейкоцитарная реакция (8,15±1,4 х 10 9 /л) наблюдалась в группе 5, получившей комбинированное лечение МСК и ЭПО (рис. 2). В группе 3 (трансплантация МСК) уровень лейкоцитов составил 4,05±2,35 х 10 9 /л, а в группе 4 (введение ЭПО) - 5,6+2,7 х 10 9 /л. В то же время в группе 2 (контроль ЛПС) данный показатель находился на уровне 6,52+1,9 х 10 9 /л. Все группы, получившие ЛПС (2-5) достоверно отличались по числу лейкоцитов в крови от здоровых животных, у которых эта цифра составила 2,15±0,41 х 10 ⁹ /л.

При сравнении уровня исследуемых цитокинов мы не обнаружили достоверных различий между группами, за исключением ИЛ-10, который в сыворотке крыс, получивших ЭПО и МСК, (58±22 пг/мл) был ниже чем в контроле ЛПС (155±90 пг/мл), приближаясь к уровню у здоровых животных (38±40 пг/мл).

Главные гистологические характеристики

□ Контроль                   □ ЛПС

□ ЛПС+МСК               □ ЛПС+ЭПО

□ лпс+мск+эпо

Рис. 2. Уровень лейкоцитов ( х 109/л) в исследуемых группах.

исследованных органов, поддающиеся количественному и полуколичественному анализу, представлены в табл. 1

При гистологическом анализе легких, почек и лимфоидных органов выявлены достоверные отличия по большинству оцениваемых показателей между группой здорового контроля и группами 2, 3 и 4. В то же время тканевые характеристики между группами 1 и 5 значимо не отличались (табл.1). В группе 5 (МСК+ЭПО) степень интерстициального отека легких была наименьшей (рис. 3), эпителий проксимальных и дистальных почечных канальцев с минимальными признаками дистрофии и некроза. У этих же животных особенно обращала на себя внимание выраженная гиперплазия белой пульпы селезенки и пролиферация Т-лимфоцитов кортикального слоя тимуса, в отличие от животных остальных групп, получивших ЛПС, у которых имела место редукция лимфоидного компонента (рис. 4). В группе ЭПО гистологические изменения практически не отличались от группы 2 (контроля сепсиса), за исключением почек, в которых имело место умеренное, но достоверное снижение степени дистрофии эпителия почечных канальцев. У крыс, получивших лечение МСК, наблюдалась положительная тенденция снижения сосудистого полнокровия легких и почек, но она уступала таковым изменениям в группе 5. Однако в данной группе наилучшие результаты по гистологической картине отмечены в паренхиме печени, которая отличалась наименьшей степенью дистрофи гепатоцитов.

Обсуждение результатов

Результаты нашего исследования в целом подтверждают гипотезу о положительном влиянии эритропоэтина на эффекты МСК в экспе-

Характеристики морфологических изменений в исследуемых группах

Таблица 1

Группы	I	II	III	IV	V
Толщина межальвеолярных перегородок (цм)	10,32 ±2,05	31,25 ±2,9	15,3 ±2,29	18,6 ± 1,1	10,8 2 ± 1,08
Дистрофия эпителия почечных канальцев (баллы)	0	2,54 ±0,31	2,22 ± 0,29	1,90 ±0,12	0,74 ±0,19
Сосудистое полнокровие ткани почек (баллы)	0,21 ±0,07	0,72 ± 0,09	0,43 ± 0,03	0,32 ± 0,05	0,24 ±0,04
Дистрофия гепатоцитов (баллы)	0	2,43 ± 0,43	1,22 ±0,45	1,92 ±0,37	2,03 ± 0,30
Объем Т-лимфоцитов коркового вещества тимуса (%)	86,24 + 2,88	34,59+ 1,34	49,37 + 2,16	38,21 + 1,73	81,48 ±2,63
Объем белой пульпы селезенки (%)	23,95 + 2,8	11,15 + 3,8	19,9 + 2,92	22,8 + 0,98	27,15 + 2,89

риментальной модели сепсиса. Тем не менее, один из важнейших показателей успешного лечения – уровень летальности, не отличался между опытными и контрольной группами, несмотря на то, что у выживших животных имели место вполне достоверные различия в степени поражения органов-мишеней. По-ви-димому, данный факт связан с особенностями эндотоксемической модели сепсиса. У животных, получающих инъекцию ЛПС, пик воспалительного ответа с освобождением множества цитокинов приходится на первый час после инъекции [14]. Мы предполагаем, что введение МСК и ЭПО через 2 часа после ЛПС уже не смогло оказать позитивного эффекта на тех животных, у которых к тому времени уже развилось критическое повреждение легких и почек. В уже цитированной работе S Mei et al уровень летальности в группах контроля и терапии МСК также достоверно не отличался, однако среди животных, которым с первого дня был назначен антибиотик, 7-дневная выживаемость в группе МСК составила 50%, в то время как в группе плацебо – менее 20% [6]. Необходимо также учесть, что доза введенных в нашем исследовании МСК (400000 клеток) в 5-7 раз ниже стандартной эффективной дозы (2000000-3000000 клеток) используемой для животных такого веса [15]. Выбор заниженной дозировки МСК был не случайным и сделан для того, чтобы более точно вычленить влия- ние эритропоэтина. Поскольку предшествующие исследования показали весьма высокие результаты лечения сепсиса МСК в привычных режимах дозирования, добавление ЭПО в такой ситуации могло не принести значительных дополнительных плюсов. Именно невысокой дозой МСК мы объясняем не столь яркие эффекты в группе 3 (получившей только МСК) в сравнении с отчетами по аналогичным экспериментам.

Особенностью динамики цитокинов в липополисахаридной модели сепсиса можно объяснить отсутствие достоверных различий в уровнях ИЛ 1β, ИЛ-6, TNF- α . Максимальная концентрация в сыворотке этих медиаторов воспаления наблюдается к концу 3-го часа после введения ЛПС. Но уже к 6-му часу уровни TNF- α и ИЛ-6 падают в 2-3 раза от максимума, полностью нормализуясь через 2 суток [16]. Наиболее долго живущий цитокин ИЛ-1β, который определяется в повышенных концентрациях до 4-5 дня эксперимента.

Лейкоцитарная реакция крови у крыс, получивших комбинацию МСК и ЭПО, оказалась достоверно выше, чем в остальных группах. Если оценивать уровень лейкоцитов только как маркер тяжести воспаления, то можно сделать вывод о неэффективности лечения. Однако если рассматривать подобную ситуацию как усиление иммунного ответа, то следует признать, что подобная комбинация напротив, более эф- фективна. Полученные результаты гематологического анализа вполне согласуются с данными морфологического исследования тимуса и се-

Рис. 3. (II) Контроль ЛПС – лейкоцитарная инфильтрация интерстиция и альвеолярных пространств, отек, утолщение межальвеолярных перегородок

лезенки, где отмечена гиперплазия коркового вещества и белой пульпы, в отличие от остальных групп, получивших ЛПС в которых наблюдалась различная степень атрофии лимфоидной ткани. Вряд ли мы сможем однозначно ответить на вопрос о механизмах такого феномена, однако, можно обсуждать несколько основных событий: во-первых, известно, что стволовые клетки подавляют экспрессию TNF- α , препятствуя апоптозу многих типов клеток, включая лимфоциты [17, 18].

Во-вторых, эритропоэтин также оказывает антиапоптозное действие на тимус и селезенку в модели сепсиса через подавление каспаз 3, 8, 11 и эндогенной продукции NO [19]. Наконец, на лейкоцитах, также как на гемопоэтических стволовых клетках, имеются рецепторы к ЭПО, через которые возможна дополнительная стимуляция лейкоцитарного ростка и увеличение продолжительности жизни лейкоцитов [20].

Попытки использовать эритропоэтин для лечения сепсиса в клинических исследованиях предпринимались неоднократно, однако его потенциальная польза, основанная на имму-нотропных и вазопрессорных эффектах, уступала связанным с ним осложнениям, прежде всего тромбозам, во многом определявшим исход заболевания [21]. Тем не менее, на уровне экспериментальных моделей сепсиса позитивные результаты ЭПО отмечены при различных токсических состояниях [22, 23] .

Наши результаты свидетельствуют, что изолированное применение ЭПО хотя и может вносить некоторый позитивный вклад в уменьшение повреждения почек и апоптоза лимфоидной ткани, в целом уступает как монотерапии низкими дозами МСК, так и комбинации МСК и ЭПО.

Рис. 3. (III) Умеренное снижение лейкоцитарной инфильтрации и отека после введения МСК

Рис. 3. (IV) Незначительное уменьшение признаков острого повреждения легких в группе ЭПО

Рис. 3. (V) Значительная редукция воспалительных изменений после введения МСК и ЭПО

Рис. 3. Репрезентативная микрофотография ткани легких в группах (гематоксилин-эозин, х 100).

Рис. 4 (I) Нормальная ткань.

Рис. 4 Репрезентативная микрофотография ткани тимуса через 72 часа после введения липополисахарида (гематоксилин-эозин х 100). Пролиферация Т-лимфоцитов коркового вещества тимуса в группе комбинированного лечения эндотоксемии МСК+ЭПО (V).

Рис. 3. (III) ЛПС+МСК

Заключение

Выполненное исследование показало, что одновременное применение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток и рекомбинатно- го эритропоэтина в эндотоксемической модели у крыс оказывает синергичный положительный эффект, превосходящий результаты раздельного лечения исследуемыми субстратами. Лучшие показатели при комбинированной терапии были достигнуты в отношении легких, почек, селезенки и тимуса. Поскольку состояние именно этих органов часто определяет исход заболевания, есть надежда, что при подтверждении данных эффектов в клинических исследованиях идея синергизма МСК и ЭПО может стать основой для нового направления лечения пациентов с тяжелым сепсисом и септическим шоком.