К вопросу об определении допустимой суточной дозы суммы n-нитрозоаминов для детей раннего возраста

Высокая уязвимость детей раннего возраста к негативному воздействию на здоровье N-нитрозоаминов обусловливает необходимость исследования их содержания в пищевых продуктах для детского питания, особенно в мясных изделиях1 [1]. Наличие этих соединений в пищевом рационе данной возрастной группы представляет существенный риск для здоровья, что подчеркивает важность разработки и применения эффективных стратегий контроля и снижения уровня N-нитрозоаминов (НА) в мясной продукции, предназначенной для детского питания. Так, в Российской Федерации в соответствии с техническими регламентами Таможенного союза регулирование содержания НА в отношении специализированных пищевых продуктов на мясной и мясорастительной основе, предназначенной для питания детей раннего возраста, определено как «не допускается более 0,01 мг/кг продукта»2. Однако данный уровень содержания N-нитрозоаминов обусловлен чувствительностью применяемого аналитического метода. Действующие российские нормативы ограничены суммарным содержанием N-нитрозодиметиламина (НДМА) и диэтилнитрозоамина (ДЭНА). Тем не менее новые методы количественного определения N-нитрозоаминов в пищевых продуктах в РФ позволяют идентифицировать, помимо нормируемых НДМА и ДЭНА, еще до семи потенциально опасных соединений этого класса3, в том числе и в специализированном детском питании [2], что при существующих нормативах может привести к недооценке риска, связанного с их общим воздействием на организм4 [3–5].

Наиболее часто выявляемыми N-нитрозоаминами в пищевых продуктах, помимо ДЭНА и НДМА, согласно данным ряда исследований [6–15], являются, N-метилэтилнитрозоамин (МЭНА), N-дипропилнитрозоамин (ДПНА), N-дибутилнитрозоамин (ДБНА), N-пиперидиннитрозоамин (ПипНА), N-дифенилнитрозоамин (ДФНА), N-морфолиннитрозоамин (МоРНА) и N-пирролидиннитрозоамин (ПиРНА). Однако не всегда и не во всех пищевых продуктах эти НА могут встречаться совместно. Так, в одних исследованиях определяются только НДМА и ДЭНА, в то время как в других исследованиях могут быть определены до 10 НА одновременно [2, 10–15]. В рамках контрольно-надзорной деятельности в странах ЕАЭС из этих соединений определяются лишь ДЭНА и НДМА. В то же время Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (EFSA) указывает на недостаточную оценку риска, ограничивающуюся лишь НДМА и ДЭНА в пищевых продуктах, поскольку другие НА также могут влиять на формирование риска для здоровья [2, 15–18]. Несмотря на то, что большинство определяемых N-нитрозоаминов относятся к категории вероятных и возможных канцерогенов, их неканцерогенные эффекты, в частности на печень, могут проявляться быстрее, чем канцерогенные, особенно у детей раннего возраста из-за особенностей развития детского организма4 [1, 3–5] и относительно непродолжительного периода потребления специализированных мясных продуктов от 6 месяцев до 3 лет. Потенциальный синергизм между N-нитрозоаминами может приводить к усилению общей токсичности всех НА, поступающих с пищевыми продуктами [17].

Кроме того, в рамках риск-ориентированного подхода регулирование содержания N-нитрозоаминов в пищевых продуктах напрямую зависит от результатов оценки канцерогенного и неканцерогенного риска. Вместе с тем для большинства N-нитрозоаминов отсутствуют параметры для оценки неканцерогенного риска. В свою очередь, исследования показывают, что многие из них могут оказывать негативное (как канцерогенное, так и однонаправленное неканцерогенное) воздействие на здоровье [14–18]. При этом проведенные ранее исследования по установлению отправных точек, таких как реперный уровень (BMD, BMDL), для последующей оценки неканцерогенного риска не в полной мере охватывают перечень НА, встречающихся в пищевых продуктах⁵ [19–21], и не оценивают их суммарного воздействия. Следует отметить, что предшествующие исследования, определявшие BMD 10 генотоксического эффекта отдельных N-нитрозоаминов [22, 23], выявили менее строгие значения по сравнению с суммарным гепатотоксическим действием четырех НА (НДМА, МЭНА, НДПА, НДБА) по уровню BMDL [17, 24].

Цель исследования – установление допустимой суточной дозы (ДСД) с учетом спектра выявленных НА при их поступлении с мясными консервами, предназначенными для питания детей раннего возраста.

Материалы и методы. Настоящее исследование является продолжением и расширением ранее проводимой работы по экспериментальному обоснованию параметров токсичности N-нитрозоаминов при поступлении с пищевыми продуктами для детей раннего возраста по критериям риска здоровью⁶ [18, 24]. Установление реперного уровня (BMDL) для выявленных НА в мясных консервах, предназначенных для детей раннего возраста, проводилось в рамках научно-исследовательской работы (2018)⁶ с использованием методики количественного определения НА [2] в исследуемых пищевых продуктах. Количественное измерение содержания нитрозоаминов в мясных консервах для детского питания осуществлялось в отношении ДМНА, МЭНА, ДЭНА, ДБНА, ДПНА, ПиПНА, ПиРНА, МоРНА, ДФНА. В исследовании применен сценарий воздействия, предполагающий суммарное поступлении N-нитрозоаминов.

В исследовании⁶ в качестве экспериментальной модели выбраны крысы линии Wistar, соответствующие возрасту (с 4 до 8 недель), который эквивалентен человеческому (от 6 месяцев до 3 лет) на протяжении всего имитационного эксперимента [25]. Животные были разделены на три группы: контрольную и две опытные (экспериментальные). Опытные группы получали мясные консервы с разными уровнями содержания N-нитрозоаминов: минимальной (группа 1) и максимальной (группа 2) концентрации [24]. Так, опытная группа 1 ( n = 30) получала мясные консервы с суммарной концентрацией N-нитрозоаминов 8,6 мкг/кг, состоящей из: 1,3 мкг/кг N-нитрозодиметиламина (НДМА), 1,3 мкг/кг N-нитрозометилэтиламина (НМЭА), 2,0 мкг/кг N-нитрозодибутиламина (НДБА), 3,1 мкг/кг дипропил-N-нитрозоамина (ДПНА), 0,3 мкг/кг N-нитрозопирролидина (ПирНА) и 0,6 мкг/кг N-нитрозопиперазина (ПиПНА). Опытная группа 2 ( n = 30) получала консервы с суммарной концентрацией N-нитрозоаминов 16,1 мкг/кг соответственно (2,0 мкг/кг НДМА, 2,6 мкг/кг НМЭА, 1,0 мкг/кг НДБА, 5,2 мкг/кг ДПНА, 2,2 мкг/кг ПирНА и 3,1 мкг/кг ПиПНА). Контрольная группа ( n = 30) получала только гранулированный корм. Остальные соединения (ДЭНА, МоРНА, ДФНА) не были обнаружены в исследуемых мясных консервах.

Кроме того, согласно дизайну эксперимента6, в исследовании все животные получали гранулиро- ванный корм, предварительно проанализированный на содержание N-нитрозоаминов. Установленные концентрации (мкг/кг) составили: НДМА – 0,83; НМЭА – 0,83; НДПА – 4,6; НДБА – 3,8; ПиПНА – 0,24; ПирНА – 7,0. Полученные данные были использованы для оценки экспозиционной нагрузки в эксперименте.

В качестве биомаркеров гепатотоксического эффекта были выбраны сывороточные показатели функции печени (АСТ, АЛТ, ГГТ, общий билирубин, щелочная фосфатаза), отражающие нарушения ее деятельности [26].

Расчет индивидуальных доз N-нитрозоаминов из мясных консервов для детского питания выполнен в соответствии с руководством Р 2.1.10.3968-237.

При оценке результатов исследуемых биохимических показателей крови на соответствие закону нормального распределения данных были применены критерии Колмогорова – Смирнова и Лиллиефорса.

Для сравнения групп и выявления статистически значимых различий ( p ≤ 0,05) был применен непараметрический U -критерий Манна – Уитни (уровень значимости установлен на уровне р < 0,05, медианы ( Me ) и интерквартильного размаха ( Q₂₅ – Q₇₅ )). Для оценки зависимости между уровнем сывороточных показателей печеночной функции и дозой (сумма N-нитрозоаминов) был применен регрессионный анализ. Анализ проводился с использованием Statistica 10.0. Статистическая значимость модели и коэффициентов оценивалась с помощью F -теста. Качество модели определялось по коэффициенту детерминации ( R ²). Выявление нижней границы дозы без наблюдаемого эффекта (BMDL) N-нитрозоаминов в мясных консервах, предназначенных для детского питания (метод скользящего окна), проводилось в соответствии с методикой по установлению и обоснованию гигиенических нормативов содержания химических примесей в пищевой продукции по критериям риска для здоровья человека, утвержденной Евразийской экономической комиссией (ЕЭК)⁸. Расчет допустимой суточной дозы (ДСД) также осуществлялся по утвержденной ЕЭК методике.

Результаты и их обсуждение. Индивидуальные дозы по сумме всех идентифицированных N-нитрозоаминов, поступающие с мясными консервами, для питания детей раннего возраста, в зависи- мости от экспериментальных групп, рассчитаны в диапазоне от 1,39·10-4 до 1,92·10-4 (опытная группа № 1) и от 1,5·10-4 до 2,03·10-4 (опытная группа № 2) мг/кг массы тела.

Оценка гепатотоксического эффекта N-нитрозоаминов проводилась с учетом индивидуальной вариабельности печеночных показателей. Для исключения влияния предсуществующих различий между группами животных на результаты эксперимента перед началом исследования были определены фоновые значения сывороточных показателей печеночной функции (АСТ, АЛТ, ГГТ, общий билирубин, щелочная фосфатаза) во всех группах (контрольной и опытных). Полученные данные представлены в табл. 1.

В связи с выявленным отклонением от нормального распределения ряда показателей (по критериям Колмогорова – Смирнова и Лиллиефорса) для сравнения групп был использован непараметрический U -критерий Манна – Уитни.

Статистический анализ ( p > 0,05) фоновых значений сывороточных показателей печеночной функции не выявил значимых различий между группами по всем исследованным показателям. Несмотря на некоторое увеличение медианных значений АЛТ и щелочной фосфатазы в опытных группах по сравнению с контрольной, эти различия не достигли статистической значимости.

В эксперименте суммарные индивидуальные дозы шести N-нитрозоаминов (6 НА), поступающие с мясными консервами для детского питания, варьировались от 24,8 до 333 нг/кг массы тела в зависимости от группы животных. После завершения экспериментального периода (28 дней), включавшего кормление животных мясными консервами, содержащими N-нитрозоамины, были оценены биохимические показатели крови (табл. 2).

Так, непараметрический U -критерий Манна – Уитни выявил статистически значимые различия ( p < 0,05) в уровнях АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочной фосфатазы и общего билирубина между контрольной группой и обеими опытными группами (№ 1 и № 2), а также между опытными группами. Полученные результаты указывают на гепатотоксическое действие исследуемых мясных консервов, содержащих N-нитрозоамины в различных концентрациях, что проявляется в достоверном повышении активности всех изученных ферментов в обеих опытных группах по сравнению с контрольными данными.

Линейный регрессионный анализ выявил статистически значимую зависимость уровня ГГТ от дозы по сумме всех выявленных НА ( R ² = 0,725, F (1,43) = 113,31, p < 0,000001), АСТ ( R ² = 0,703, F (1,43) = 101,55, p < 0,000001), АЛТ ( R ² = 0,448, F (1,43) = 34,97, p <  0,000001) и щелочной фосфатазы ( R ² = 0,310, F (1,43) = 19,32, p = 0,000071), а также умеренную зависимость общего билирубина от дозы по сумме всех выявленных НА ( R ² = 0,249, F (1,43) = 14,29, p = 0,00048).

Полученные результаты регрессионного анализа свидетельствуют о зависимости между дозой и нарушением функции печени по показателям ГГТ, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы и общего билирубина. Коэффициенты детерминации ( R ²) для исследуемых показателей демонстрируют, что значительная часть изменений в их уровнях объясняется воздействием различных доз. Наблюдаемые изменения печеночных показателей связаны с воздействием N-нитрозоаминов после 28-дневного кормления крыс мясными консервами для детского питания, содержащими N-нитрозоамины. Таким образом, результаты исследования позволяют предположить, что эти печеночные показатели могут выступать в качестве биомаркеров эффекта НА.

Таблица 1

Биохимические показатели крови 4-недельных крыс (эквивалент возрасту 6 месяцев человека), рассчитанные по медиане ( Me [ Q 25 ; Q 75 ])

Биохимические показатели крови	Контрольная группа	Опытная группа № 1	Опытная группа № 2
АСТ, Е/л	126 [124; 130]	129 [121,5; 132]	129 [124; 133]
АЛТ, Е/л	49 [42; 53,5]	55 [38; 63,5]	55 [44,5; 60,5]
ГГТ, Е/л	3 [0; 5]	3 [0; 3]	3,1 [3; 3,5]
Щелочная фосфатаза, Е/л	417 [385; 436]	439[390; 485,5]	440 [423; 500,5]
Общий билирубин, мкмоль/л	0,8 [0,5; 1,1]	0,8 [0,7; 1,0]	0,8 [0,7; 1,0]

Таблица 2

Биохимические показатели крови 8-недельных крыс (эквивалент возраста 3 лет человека) после 28-дневного кормления мясными консервами для детского питания, содержащими N-нитрозоамины ( Me [ Q 25 ; Q 75 ])

Биохимические показатели крови	Контрольная группа	Опытная группа № 1	Опытная группа № 2
АСТ, Е/л	129 [119,5; 131,5]	209 [194,5; 219]	231 [215; 264,5]
АЛТ, Е/л	70 [64; 72,5]	80 [73; 88]	111 [97; 130]
ГГТ, Е/л	3 [2; 3]	8 [7,5; 8]	9 [8; 9,5]
Щелочная фосфатаза, Е/л	219 [189,5; 271]	299 [287,5; 391]	379 [290; 459]
Общий билирубин, мкмоль/л	0,8 [0,6; 1,0]	0,8 [0,6; 1,2]	1,4 [1,3; 1,5]

Для установления BMDL N-нитрозоаминов, содержащихся в мясных консервах, для детей раннего возраста было проведено математическое моделирование зависимости вероятности повышения гепатотоксического эффекта от суммарной дозы нитрозоаминов с использованием метода скользящего окна. Этот подход позволил учесть потенциальную нелинейность зависимости и локальные вариации в уровнях биомаркеров эффекта.

В результате анализа установлен BMDL по сумме НДМА, МЭНА, НДПА, НДБА, ПиПНА и ПирНА только по показателю ГГТ на уровне 0,000175 мг/кг массы тела. Это значение указывает, что при суммарной концентрации N-нитрозоаминов ниже этого уровня не наблюдается статистически значимого повышения уровня ГГТ.

Параметры статистической модели, описывающей зависимость «доза – ответ» между суммарной дозой нитрозоаминов и вероятностью повышения уровня γ-глутамилтрансферазы, представлены в табл. 3.

Ранее было установлено значение BMDL, равное 0,633 мкг/кг массы тела [24]. Значение BMDL для аналогичного эффекта, полученное в настоящем исследовании, отличается (0,175 мкг/кг массы тела). Отличия в результатах обусловлены различным спектром анализируемых N-нитрозоаминов: предыдущее исследование оценивало суммарное воздействие четырех НА (НДМА, МЭНА, НБДА, НДПА), в то время как в настоящем исследовании анализировалось воздействие шести НА (НДМА, МЭНА, НДПА, НДБА, ПиПНА, ПирНА). Более низкое значение BMDL в настоящем исследовании может быть обусловлено как расширенным спектром определяемых НА, так и потенциальным синергизмом между ними [17].

Экстраполяция экспериментальных результатов с животной модели на человека с целью определения допустимой суточной дозы (ДСД) учитывала модифицирующий фактор 40 (отражающий отклонение от идеальных условий эксперимента), представляющий собой произведение факторов: минимальное отличие уровня экспозиции от реального потребления (фактор 2); использование BMD в качестве отправной точки для определения ДСД (фактор 2); межвидовая экстраполяция результатов, обусловленная выполнением исследования с использованием одного вида животных (фактор 10)9. В результате применения модифицирующих факторов установлена ДСД для суммы 6 НА на уровне 4,38 нг/кг массы тела.

При этом применение одних и тех же модифицирующих факторов для суммы 4-N-нитрозоаминов позволило установить ДСД на уровне 15,8 нг/кг массы тела. Для сравнения: Европейское медицинское агентство (European medical Agency, EMA) установило ДСД для всех выявляемых НА на уровне 18 нг/кг массы тела в день по ДЭНА [27].

Исследование показало, что совместное воздействие расширенного спектра N-нитрозоаминов с однонаправленным эффектом приводит к усилению негативного влияния по сравнению с воздействием меньшего набора НА в предыдущем исследовании. Это обусловливает снижение ДСД для суммарного воздействия НА.

Поэтому для адекватной оценки риска и установления безопасных уровней необходимо оценивать суммарное поступление всех идентифицируемых НА с мясными консервами, предназначенными для питания детей раннего возраста. Полученные результаты подчеркивают необходимость дальнейших исследований для более точного определения характера взаимодействия различных НА и уточнения их суммарного токсического эффекта.

Выводы. При химико-аналитическом исследовании мясных консервов, предназначенных для питания детей раннего возраста, определено шесть НА: НДМА, МЭНА, НДПА, НДБА, ПиПНА и ПирНА. На основании количественного определения НА и данных сывороточных показателей печеночной функции рассчитан реперный уровень (BMDL) по критерию гепатотоксичности – 0,178 мкг/кг массы тела в день по их сумме, что значительно ниже ранее опубликованного значения (0,633 мкг/кг массы тела в день), полученного на основании аналогичного исследования по четырем НА (НДМА, МЭНА, НДПА, НДБА). Соответственно, с применением аналогичных модифицирующих факторов для шести НА допустимая суточная доза составила

Таблица 3

Параметры модели зависимости вероятности повышения гепатотоксического эффекта (ГГТ) от суммарной дозы нитрозоаминов

Вероятность развития эффекта	Показатель	Показатель гепатотоксического эффекта	b 0	Ошибка	b 1	F	p	R 2	НУ (мг/кг м.т.)
Повышение уровня	Доза нитрозоаминов (по их сумме)	ГГТ	1,175219	0,000152	590,24	97,01	0,000	0,626	0,000175

4,38 нг/кг массы тела в день, что ниже ДСД, установленной по сумме четырех НА (15,8 нг/кг массы тела в день). Результаты исследования демонстрируют нарастание негативного влияния при совместном воздействии расширенного спектра N-нитрозоаминов вследствие их однонаправленного действия, учитывающего большее количество НА в сравнении с предыдущим исследованием. Это подчеркивает целесообразность учета полного спектра выявленных НА при оценке риска.

Кроме того, полученные результаты подтверждают целесообразность гигиенического нормирования по сумме НДМА и ДЭНА, однако при этом необходимо рассмотреть вопрос о нормировании суммы шести НА в пищевом продукте.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.