Кадмий индуцированные изменения свойств микобактерий

Тяжелые металлы, обладающие кумулятивными свойствами, способны накапливаться и влиять на метаболические процессы, оказывать иммуносупрессивное действие, что характеризует их как одних из основных полютантов окружающей среды. Особую опасность представляет кадмий, который угнетает факторы неспецифического иммунитета, ингибирует активность антиоксидантной системы, приводит к образованию свободных радикалов и усилению процессов перекисного окисления липидов [4]. Было установлено, что на фоне хронической интоксикации хлоридом кадмия (CdCl 2 ) при экспериментальном туберкулезе наблюдаются замедление роста и развития кроликов, изменение показателей теплового обмена и клинико-биохимических показателей крови [1], морфофункциональные нарушения внутренних органов [2].

Целью данной работы явилось – определение свойств Mycobacterium bovis

Bovinus-8, выделенного из органов кроликов, зараженных на фоне интоксикации CdCl2.

Материалы и методы. В работе использовали возбудитель туберкулеза штамм М.bovis Bovinus-8, CdCl 2 (ГОСТ 4330-66), в качестве модельных животных – кроликов.

Микобактерии выращивали в течение 6 недель, снимали с поверхности питательной среды и промывали физиологическим раствором. Полученную бактериальную массу использовали для заражения кроликов. Схема опыта на модельных животных представлена в табл. 1, а более подробно описана ранее [1; 2].

Через 60 сут после заражения проводили убой, а из органов и тканей готовили суспензии по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши с последующим посевом на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 8 недель.

Таблица 1 - Схема опыта

Группа	Хроническая интоксикация	Инфицирование
1 n=3	ежедневно в течение 60 сут перорально CdCl 2 - 1,5 мг/кг	подкожно 1 мл физиологического раствора
2 n=3	ежедневно в течение 60 сут перорально плацебо (вода)	подкожно 1 мл суспензии М.bovis Bovinus-8 (10 ЕД м.т./мл)
3 n=3	ежедневно в течение 60 сут перорально CdCl 2 - 1,5 мг/кг	подкожно 1 мл суспензии М.bovis Bovinus-8 (10 ЕД м.т./мл)
4 n=3	ежедневно в течение 60 сут перорально плацебо (вода)	подкожно 1 мл физиологического раствора

Изменчивость M.bovis Bovinus-8, его культурально-морфологические и биохимические свойства определяли, отслеживая скорость роста бактерий на питательных средах, количество и морфологию колоний, способность бактерий продуцировать ниацин, вырабатывать нитратредуктазу, каталазу и кислую фосфатазу по стандартным методикам [3]. В качестве контроля использовали исходную культуру штамма M.bovis Bovinus-8 и референс-штамм M.tuberculosis H37Rv, выращенные в стандартных условиях. Фенотипическую изменчивость возбудителя определяли световой микроскопией (окрашивание по Циль-Нильсену) и сканирующей автоэмиссионной электронной микроскопией (СЭМ) с использованием универсального аналитического комплекса Merlin (Carl Zeiss). СЭМ проводили на базе лаборатории Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» КФУ. Предварительно биологические препараты проходили процесс инактивации и дегидротации через градиент спиртов восходящей концентрации. Далее на покровные стекла с фиксированным мазком суспензий микобактерий и высушенными образцами органов наносили токопроводящий слой методом напыления золота-палладия в вакуумной камере Quorum.

Белковый спектр возбудителя изучали методом электрофореза в разделяющем 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием азотнокислым серебром. Клетки разрушали на приборе Fast Prep-24 с использованием Blue Matrix Tube. Результаты электрофореза документировали на Gel Doc ХR+ Sistem (BioRad) и обрабатывали с использованием программного обеспечения «Image Lab Software».

Результаты и обсуждение. Видимый рост клеток при культивировании микобактерий выделенных из органов животных инфицированных M.bovis Bovinus-8 на фоне хронической интоксикации CdCl 2 (3-я группа)

наблюдали через 5 недель, тогда как контрольный штамм и клетки, выделенные из органов кроликов 2-ой группы, давали рост уже начиная с 3 недели. При этом количество и размер колоний уменьшались, а при смыве с поверхности питательной среды физиологическим раствором взвесь клеток микобактерий была негомогенна, что характерно для S-форм.

При анализе результатов биохимических тестов, каких либо различий между клетками, выделенными из органов кроликов 3-ей группы и контрольными штаммами не выявлено. Все показатели соответствовали общепринятым биохимическим свойствам исследуемого штамма микобактерий.

Фенотипическая изменчивость штамма M.bovis Bovinus-8 под влиянием хлорида кадмия не установлена. Форма и окрас клеток соответствовали контрольному штамму (рис. 1).

Рис. 1 - Сканирующая автоэмиссионная электронная микроскопия клеток M.bovis Bovinus-8: А - клетки выделенные из органов кроликов инфицированных M.bovis Bovinus-8 на фоне хронической интоксикации CdCl 2 ; В - контрольный штамм M.bovis Bovinus-8

В результате проведенного анализа гелей выявлено большее количество фракций электрофоретической разгонки проб обработанных на приборе Fast Prep по сравнению с исходными клетками (рис. 2).

Обработка позволяет болеее детально анализировать клеточные фрагменты. Выявлено некоторое различие в полипептидном спектре разрушенных клеток M.bovis Bovinus-8, выделенных из органов кроликов 3-ей группы, по сравнению с контрольным штаммом. Данное обстоятельство указывает на то, что для выяснения причины различий белковых спектров необходимо продолжить пассирование клеток.

Рис. 2 - Электрофорез клеток M.bovis Bovinus-8:

А (клетки выделенные из органов кроликов инфицированных M.bovis Bovinus-8 на фоне хронической интоксикации CdCl 2 ): 1 – взвесь разрушенных клеток на приборе Fast Prep (лизат); 2 – cупернатант разрушенных клеток (лизат) на приборе Fast Prep; 3 – исходные; 4 – маркер Bio Rad broad range;

В (контрольный штамм M.bovis ): 1 – взвесь разрушенных клеток на приборе Fast Prep (лизат); 2 – cупернатант разрушенных клеток (лизат) на приборе Fast Prep; 3 – исходные клетки;

4 – маркер Bio Rad broad range

Заключение. Изучены культуральноморфологические, биохимические свойства микобактерий, определена фенотипическая изменчивость возбудителя под влиянием солей тяжелых металлов. Установлено замедление роста и изменение морфологии колоний штамма M.bovis Bovinus-8 под влиянием CdCl 2 . При этом биохимические свойства микобактерий, способность продуцировать ниацин, вырабатывать нитратредуктазу, каталазу и кислую фосфатазу, под влиянием солей тяжелых металлов не изменяются . Фенотипически клетки, выделенные из органов кроликов инфицированных M.bovis Bovinus-8 на фоне хронической интоксикации CdCl₂ соответствовали контрольному штамму. Однако выявлено некоторое различие в полипептидном спектре, что требует дополнительных исследований.

Резюме

Исследованы культурально-морфологические, биохимические свойства возбудителя M.bovis Bovinus-8, определена его фенотипическая изменчивость под влиянием кадмия хлорида. Установлено замедление роста и изменение морфологии колоний, при этом основные биохимические свойства не изменились . Выявлено различие в полипептидном спектре возбудителя, выделенного из органов кроликов, подвергнутых интоксикации, по сравнению с контрольным штаммом. Для выяснения причины различий белковых спектров необходимы дополнительные исследования.